miR-27a在老年急性髓系白血病骨髓單個核細胞中表達及與預后的關系

李愛國 楊連華 徐 剛 冀春梅

(濰坊醫學院青州臨床學院輸血科，山東 濰坊 262500)

miR-27a在老年急性髓系白血病骨髓單個核細胞中表達及與預后的關系

李愛國 楊連華 徐 剛1冀春梅

(濰坊醫學院青州臨床學院輸血科，山東 濰坊 262500)

目的探討miR-27a在老年急性髓系白血病(AMI)患者骨髓單個核細胞中表達及與預后的關系。方法 選取初治老年AMI患者95例，以行骨髓標本檢查的非白血病老年人35例作為對照組，所有患者采取小劑量MA方案治療，利用實時熒光定量PCR技術檢測骨髓單個核細胞中miR-27a表達。所有患者均隨訪至2016年4月30日，以miR-27a相對表達量的P25值為界值，將患者分為低表達組(n=24)和高表達組(n=71)，利用Kaplan-Meier法對miR-27a相對表達量對患者總體生存時間的影響進行分析。結果 老年AMI患者骨髓單個核細胞中miR-27a相對表達量高于對照組，且單核系高于非單核系(P<0.05)；老年AMI患者骨髓單個核細胞中miR-27a相對表達量與年齡、細胞遺傳學、FLT3-ITD基因、NPM1/FLT3-ITD基因、白細胞(WBC)分組、首療程治療效果和NCCN預后分組有關(P<0.05)；Kaplan-Meier生存分析顯示，低表達組患者中位總體生存時間15.6個月，高表達組中位總體生存時間9.3個月，Log Rank檢驗差異有統計學意義(χ2=14.488，P<0.001)。結論 miR-27a在老年AMI患者骨髓單個核細胞中呈高表達，且與年齡、染色體核型、基因位點突變及患者預后有關，有望為老年AMI基因治療及機制研究提供新的線索。

急性髓系白血??；miR-27a；骨髓單個核細胞

急性髓系白血病(AMI)65歲以上人群發病率顯著增加〔1〕。近年雖然臨床治療AMI技術不斷進步，患者臨床療效顯著提高，但老年患者總體預后依然較差〔2〕，一方面與老年患者器官代謝功能下降、基礎疾病較多有關〔3〕，另一方面也與老年AMI疾病本身分子生物學及細胞遺傳學異常有關〔4〕。微小RNA(miRNA)作為真核生物中高度保守的短小RNA，廣泛參與機體生理和病理過程調控。miRNA可通過發揮類似抑癌基因或癌基因的功能而參與多種腫瘤的發生及進展過程中〔5〕。miR-27a作為miRNA重要類型，在多種惡性腫瘤組織中呈高表達，可通過調控配體蛋白表達而影響腫瘤細胞增殖和侵襲能力〔6〕。本研究擬對老年AMI骨髓單個核細胞中miR-27a表達進行分析，探討其在老年AMI發病中的作用及對患者預后的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2008年3月至2013年4月在我院治療的初治老年AMI患者95例，其中，男性57例，女性38例，中位年齡64歲，納入標準：①年齡60～79歲；②均經骨髓細胞學、形態學及免疫表型檢查確診；③初診病例，骨髓采集前未接受過任何治療。FAB分型：M0 1例、M1 2例、M2 27例、M3 4例、M4 13例、M5 44例、M6 4例；其中，單核系(M4和M5)57例，非單核系(M0、M1、M2、M3、M6)38例；根據細胞遺傳學分組：正常核型51例、復雜核型24例、染色體單體核型20例。同期選取35例行骨髓標本檢查的非白血病老年人作為對照組，年齡60～80歲，骨髓形態學檢查排除血液系統疾病。

1.2 主要試劑和儀器 Trizol總RNA提取試劑盒購自美國Biomiga公司，逆轉錄和PCR試劑盒均購自大連寶生物公司，miR-27a及內參U6引物均由上海生工公司設計合成，Ficoll淋巴細胞分離液購自上海信裕生物公司，實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 治療方案 根據中國AMI治療指南，采取推薦的小劑量MA方案。對于血紅蛋白<70 g/L或出現明顯貧血患者，給予懸浮紅細胞輸注；對于中性粒細胞計數<0.5×109/L患者，給予皮下注射200 μg·m-2·d-1的G-CSF；對于血小板(PLT)<20×109/L患者，給予單采血小板。

1.3.2 治療效果評估 根據患者誘導緩解治療第26天時骨髓中幼稚細胞比例將患者分為：首療程緩解組：幼稚細胞比例<5%；首療程未緩解組：幼稚細胞比例≥5%。根據2013年NCCN關于AML預后分組標準〔7〕：預后良好組6例、預后中等組66例和預后不良組28例。

1.3.3 病例隨訪 所有患者均隨訪至2016年4月30日方式包括電話、查閱門診記錄及住院記錄等，未出現失訪病例。

1.3.4 標本采集及處理 所有患者均于初診行化療治療前無菌操作下留取骨髓標本3 ml，對照組采用相同方法留取骨髓標本，用肝素抗凝，利用Ficoll淋巴細胞分離液對骨髓中單個核細胞進行分離，保存于-80℃冰箱以備檢。

1.3.5 利用實時熒光定量PCR技術檢測骨髓單個核細胞中miR-27a表達 取骨髓單個核細胞標本，加入細胞裂解液裂解，用Trizol總RNA提取試劑盒對總RNA進行提取，并用全波長酶標儀檢測總RNA純度，取A260/A280≥1.80作為合格樣品。利用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為模板鏈cDNA，以cDNA為模板行PCR。引物序列分別為：miR-27a引物：上游：5′-TTCACAGTGGCTAAG-3′，下游：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6引物：上游：5′-TCAGTTGCTGTTCTGGGTG-3′，下游：5′-CGGTTGGCTGGAAAGGAG-3′。PCR反應條件：94℃ 60 s，92℃ 45 s，56℃ 30 s，74℃ 30 s，連續進行38次循環。每個樣品均設置三個平行反應復孔。用2-△△Ct法獲得骨髓單個核細胞中miR-27a 168相對表達量。

1.4 統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析及LSD-t檢驗。以骨髓單個核細胞中miR-27a相對表達量的P25值為界值，利用Kaplan-Meier法對miR-27a相對表達量對患者總體生存時間的影響進行分析。

2 結 果

2.1 老年AMI患者和對照組骨髓單個核細胞中miR-27a表達比較 老年AMI患者骨髓單個核細胞中miR-27a相對表達量高于對照組，且高于非單核系(P<0.05)，見表1。

2.2 老年AMI患者骨髓單個核細胞中miR-27a表達與臨床病理特征之間的關系 老年AMI患者骨髓單個核細胞中miR-27a相對表達量與性別無關，而與年齡、細胞遺傳學、FLT3-ITD基因、NPM1/FLT3-ITD基因、WBC分組、首療程治療效果和NCCN預后有關(P<0.05)，見表2。

組別nmiR?27a相對表達量老年AMI患者951 48±0 191)非單核系571 37±0 121)單核系381 68±0 141)2)對照組351 07±0 11F值234 679P值<0 001

與對照組相比:1)P<0.05；與非單核系相比:2)P<0.05

指標miR?27a表達量t或F值P值性別 男1 49±0 210 7920 618 女1 46±0 18年齡(歲) ≥701 64±0 1717 664<0 001 <701 33±0 15細胞遺傳學正常核型1 29±0 1615 739<0 001復雜核型1 68±0 131)染色體單體核型1 71±0 151)FLT3?ITD基因陽性1 69±0 1813 867<0 001陰性1 31±0 14NPM1/FLT3?ITD基因NPM1+/FLT3?ITD-1 30±0 1119 743<0 001NPM1?FLT3?ITD-1 79±0 16WBC分組(×109/L)≥1001 74±0 2018 281<0 001<1001 34±0 15首療程治療效果緩解組1 27±0 1421 642<0 001未緩解組1 77±0 16NCCN預后分組預后良好組1 21±0 132)3)39 573<0 001預后中等組1 39±0 152)預后不良組1 73±0 17

與正常核型比較：1)P<0.05；與預后不良組比較：2)P<0.05；與預后中等組比較：3)P<0.05

2.3 老年AMI患者骨髓單個核細胞中miR-27a表達對患者總體生存時間的影響 以骨髓單個核細胞中miR-27a相對表達量的P25值為界值，將患者分為低表達組(n=24)和高表達組(n=71)，Kaplan-Meier生存分析顯示，低表達組患者中位總體生存時間15.6個月，高表達組中位總體生存時間9.3個月，Log Rank檢驗差異有統計學意義(χ2=14.488，P<0.001)。

3 討 論

AMI作為成人最為常見的白血病，是正常髓系細胞分化發育中不同階段造血祖細胞惡化而來。雖然近年來臨床上治療AMI的手段不斷完善，但老年AMI患者總體預后并未得到改善，相比于年輕患者，其緩解率、無病生存率及總體生存率均較低〔8〕。究其原因，除了與老年患者自身體質條件有關，越來越多的研究指向分子生物學異常和細胞遺傳學對患者預后的影響。miRNA作為廣泛參與機體生理、病理過程的穩定存在于機體內的高度保守的短小RNA，在細胞分化、增殖、凋亡、遷移等過程中發揮重要作用，又可發揮抑癌或促癌基因的功能而參與惡性腫瘤的發生及進展過程中〔9〕。有研究指出〔10〕，特異的miRNA表達譜與AMI細胞遺傳學及患者預后關系密切。miR-27a作為miRNA類型之一，參與了多種惡性腫瘤發生及進展過程〔11〕，且與兒童急性淋巴細胞白血病復發〔12〕、白血病耐藥〔13〕等有關。本研究結果顯示，老年AMI患者骨髓單個核細胞中miR-27a相對表達量高于對照組，說明miR-27a在老年AMI骨髓單個核細胞中呈高表達，可能參與了發病過程，且單核系高于非單核系，進一步提示miA-27a在老年AMI患者骨髓單個核細胞中表達與骨髓細胞形態有關。

本研究顯示，年齡、染色體核型、基因位點突變及WBC數是影響患者預后的重要因素〔14〕，提示可能與患者預后有關，且與AMI患者染色體核型及基因突變有關，但具體作用機制尚待進一步明確，我們推測，可能是miR-27a在異常調控髓系細胞分化發育中，異常增殖、分化的造血祖細胞加劇了染色體核型及基因突變的發生。進一步分析發現，miR-27a可能與患者治療效果及預后有關。有研究發現，miR-27a在構建的阿霉素耐藥Raji細胞株中呈高表達〔15〕。結合本研究，我們推測，可能是miR-27a參與了老年AMI患者耐化療藥物的發生而影響患者預后，老年AMI患者骨髓單個核細胞中miR-27a表達量與患者預后密切相關。

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〔2015-12-09修回〕

(編輯 李相軍)

遼寧省自然科學基金(2013021039)

冀春梅(1964-)，女，副主任檢驗科，主要從事臨床生化研究。

李愛國(1970-),男,主管檢驗師，主要從事血液檢驗、輸血研究。

R7

A

1005-9202(2016)24-6153-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.051

1.中國醫科大學第四醫院