Ras相關區域1A基因異常甲基化與甲狀腺癌關聯的Meta分析

馬建贏 胡如進 柯立池 馮紅芳 劉 鋼 唐燕華

(鄂東醫療集團黃石市中心醫院(湖北理工學院附屬醫院)乳甲外科，湖北 黃石 435000)

Ras相關區域1A基因異常甲基化與甲狀腺癌關聯的Meta分析

馬建贏 胡如進 柯立池 馮紅芳 劉 鋼 唐燕華1

(鄂東醫療集團黃石市中心醫院(湖北理工學院附屬醫院)乳甲外科，湖北 黃石 435000)

目的 應用meta分析的方法對比已經在國內外公開發表的關于Ras相關區域1A(RASSF1A)基因異常甲基化與甲狀腺癌的臨床綜合研究。方法 采用Cochrane系統評價方法，計算機檢索pubmed，EMBASE,MEDLINE,Cochrane協作網數據庫，中國生物醫學文獻數據庫，萬方數據庫等數據庫的文獻，收集有關比較RASSF1A基因異常甲基化與甲狀腺癌的對照研究實驗，并評價入選研究的質量。結果 共納入符合標準的文獻11篇，共803例患者，且11篇均為臨床對照實驗(CCT)。Meta分析結果顯示：與對照組相比，甲狀腺乳頭狀癌組的RASSF1A基因甲基化率高于對照組(95%CI：1.51～11.27，P<0.05)。但RASSF1A基因甲基化與甲狀腺癌的性別無統計學差異(OR=0.61，95%CI：0.21～1.35，P>0.05)。RASSF1A基因甲基化在50歲分界組無統計學意義，但RASSF1A基因甲基化在40歲分界組有統計學意義，即>40歲組RASSF1A基因甲基化表達增加(95%CI：1.38～6.73，P<0.05)。RASSF1A基因甲基化與甲狀腺癌的浸潤與轉移有統計學差異(OR=4.03，95%CI：1.39～11.75，P<0.05)。結論 RASSF1A甲基化是甲狀腺乳頭狀癌的危險因素，在甲狀腺乳頭狀癌的發生、發展中起到重要的作用；RASSF1A甲基化與性別無明顯相關性，甲狀腺癌浸潤轉移組的RASSF1A基因甲基化陽性率高于與無浸潤轉移組，但與年齡相關性仍然需要大樣本多中心的研究。

甲狀腺腫瘤；乳頭狀甲狀腺癌；DNA甲基化；RASSF1A;Meta分析

甲狀腺癌根據組織類型不同分為甲狀腺乳頭狀癌(PTC)、甲狀腺濾泡狀癌(FTC)、髓樣癌(MTC)、未分化癌(UTC)。其中PTC是最常見的一種類型。國內數據提示PTC占成人甲狀腺癌的60%和兒童甲狀腺癌的全部。美國一項研究數據提示PTC占所有甲狀腺癌的85%〔1〕，盡管PTC惡性程度較低，但是近年來甲狀腺癌的發病率越來越高〔2〕。DNA甲基化被認為與PTC有密切的關系〔3〕。本文采用Meta分析方法，系統性比較Ras相關區域1A(RASSF1A)基因異常甲基化與甲狀腺癌的關聯，以期對于高危人群的篩選以及甲狀腺癌的早診斷起到積極的參考作用。

1 材料與方法

1.1 文獻納入與排除標準

1.1.1 文獻納入標準 (1)研究類型：臨床對照實驗(CCT)或隨機對照試驗，若數據符合病例對照設計的要求亦可，語種與時間不受限制；(2)研究樣本：甲狀腺癌組織標本均通過術后的病理檢查確診，對照組則為癌旁組織或者良性的甲狀腺組織、正常的甲狀腺組織；(3)所有研究關于RASSF1A基因甲基化與PTC相關性的文獻；(4)所有納入的文獻都有數據提供，若數據不全，則聯系作者獲取相關數據。

1.1.2 文獻排除標準 (1)甲狀腺癌的診斷無病理診斷作為依據；(2)缺乏明確的RASSF1A基因甲基化的檢測方法；(3)綜述，動物實驗，案例報道除外；(4)重復發表，資料不完整的文獻；(5)非對照試驗研究。

1.2 檢索策略 計算機檢索Cochrane 圖書館、中國知網、萬方數據庫、CBM、pubmed及Medline、EMBASE數據庫，收集2016年2月以前發表的關于RASSF1A基因異常甲基化與甲狀腺癌關聯的文獻，中文檢索詞包括：甲狀腺腫瘤；PTC；基因；DNA甲基化；RASSF1A；Meta分析。英文檢索詞包括：thyroid cancer;papillary thyroid carcinoma;gene;DNA methylation;RASSF1A;meta analysis。

1.3 資料提取 2名研究者獨立獲取相關信息，然后交叉互相核查結果。如果遇分歧，則協商解決。內容主要包括基本信息(題目、出處、第一作者、單位，發表日期)、研究方法學特征、研究對象特征(樣本量的大小、年齡、性別、病理組織學類型、腫瘤分期)等。

1.4 文獻質量評價 隨機對照試驗參照Cochrane Reviewer Handbook 5.1偏倚風險評估標準進行質量評價，包括隨機序列生成、分配隱藏、盲法、數據不完整、選擇性報告結果、其他可能的偏倚等。非隨機對照研究用Cochrane協作網推薦的偏倚風險評估方法(NOS)進行質量評價，包括組間可比性和結果評價。如NOS量表評分≥6分，則認為該質量較高。此評價由2名研究者單獨進行，如遇分歧則通過討論或由新的第3名研究者解決。

1.5 統計學方法 采用RevMan 5.3軟件。二分類變量則采用優勢比(OR)作為合并統計量；連續型變量采用加權均數差(WMD)或標準化均數差(SMD)作為合并統計量；計算95%可信區間(CI)。分析各研究間的異質性采用χ2檢驗，如研究結果間無異質性(P>0.05,I2<50%)，采用固定效應模型。如研究結果間存在異質性(P<0.05，I2>50%)，采用隨機效應模型。當納入的研究較多時，采用漏斗圖檢驗發表偏倚。

2 結 果

2.1 文獻納入結果 計算機檢索相關數據庫檢出相關文獻1 489篇。通過閱讀文題、摘要以及全文后，最終納入11篇文獻〔4～14〕，其中英文文獻4篇，中文文獻7篇。0篇隨機對照試驗，11篇CCT。見圖1。

2.2 納入Meta分析的文獻基本情況 見表1。

2.3 納入研究的文獻的質量評價 見表1。

2.4 Meta分析結果

2.4.1 RASSF1A基因甲基化在PTC組與對照組表達的結果分析 11篇CCT〔4～14〕報道了RASSF1A基因甲基化在PTC組與對照組表達的情況。各項研究結果之間存在異質性(I2=79%，P<0.05)，采用隨機效應模型合并統計量。結果顯示：PTC組的RASSF1A基因甲基化率高于對照組(95%CI：1.51～11.27，P<0.05)。見圖2。

2.4.2 RASSF1A基因甲基化與PTC性別的結果分析 3篇CCT〔8,10,14〕報道了RASSF1A基因甲基化與性別的關聯分析。各研究結果間不存在異質性(I2=0%，P>0.05)，采用固定效應模型合并統計量。結果顯示：RASSF1A基因甲基化與甲狀腺癌的性別差異無統計學意義(OR=0.61，95%CI：0.21～1.35，P>0.05)。見圖3。

圖1 文獻篩選途徑

表1 納入文獻基本情況

圖2 RASSF1A基因甲基化在實驗組與對照組表達的Meta分析

圖3 RASSF1A基因甲基化與甲狀腺癌患者性別的關系

2.4.3 RASSF1A基因甲基化與年齡的結果分析 3篇CCT〔8，10，14〕報道了RASSF1A基因甲基化與年齡的關系，其中一篇報道的是>40歲和<40組，另外兩篇研究的均是>50歲和<50歲組，將研究相同的進行分組統計，研究提示不存在異質性(I2=0%，P>0.05)，采用固定效應模型合并統計量。結果顯示：RASSF1A基因甲基化與年齡差異無統計學意義(P>0.05)，即RASSF1A基因甲基化在50歲分界組無統計學意義。但總體存在統計學異質性，采用固定效應模型合并統計量，兩組差異有統計學意義(95%CI：1.38～6.73，P<0.05)，即RASSF1A基因甲基化在40歲分界組有統計學意義，即>40歲組RASSF1A基因甲基化表達增加。見圖4。

2.4.4 RASSF1A基因甲基化與PTC浸潤與轉移的結果分析 2篇CCT〔8,10〕報道了RASSF1A基因甲基化與PTC浸潤與轉移的關聯分析。各研究結果間不存在異質性(I2=0%，P>0.05)，采用固定效應模型合并統計量。結果顯示：RASSF1A基因甲基化與甲狀腺癌的浸潤與轉移差異有統計學意義(OR=4.03，95%CI：1.39～11.75，P<0.05)，即可以認為甲狀腺癌浸潤轉移組的RASSF1A基因甲基化陽性率高于與無浸潤轉移組。見圖5。

2.5 發表偏倚 漏斗圖分析提示納入的研究潛在發表偏倚的風險。見圖6。

2.6 敏感性分析 由于研究指標“RASSF1A基因甲基化在PTC組與對照組表達”存在異質性(I2=89%)，但是去除徐美容等〔8〕的研究后異質性顯著降低(I2=41%)，且研究最終結果沒有改變，仍然存在統計學意義(P<0.05)，去除徐美容等〔8〕研究后異質性為0，總體仍有統計學意義，表明納入的文章質量良好。見圖7。

圖4 RASSF1A基因甲基化與年齡的關系

圖5 RASSF1A基因甲基化與浸潤與轉移的關系

圖6 RASSF1A基因甲基化在甲狀腺乳頭狀癌組與對照組的結果分析的漏斗圖

圖7 敏感性分析

3 討 論

甲狀腺癌是臨床上最多見的起源于甲狀腺上皮細胞的內分泌系統惡性腫瘤，目前病因學不明確，隨著表觀遺傳學的快速發展，人們越來越重視其在腫瘤的發生發展的重要作用。最近研究比較多的表觀遺傳學是DNA甲基化，DNA甲基化與癌基因，抑癌基因的轉錄有一定的關系，癌基因的去甲基化以及抑癌基因的高度甲基化都可能導致腫瘤的發生并可能促進腫瘤的快速發展。國內外研究顯示，甲狀腺腫瘤與p53,p16,RASSF1A等相關基因有關聯，其中RASSF1A為新近研究的一種基因，基因庫查詢知，其位于人類染色體3p21.3，該區域較常見的出現雜合子和純合子的丟失最終導致腫瘤的發生〔15,16〕，然而對于RASSF1A與PTC的相關性仍然處于初步的探索階段。

本研究最終納入英文文獻4篇，中文文獻7篇，共包含803名受試者。對于RASSF1A基因甲基化在PTC組與對照組表達的結果分析提示PTC組的RASSF1A基因甲基化率高于對照組，與最近Mohammadiasl等〔17〕研究的結果符合，故可以認為RASSF1A甲基化是PTC的危險因素，在PTC的發生、發展中起到重要的作用。RASSF1A基因甲基化與年齡研究的結果提示RASSF1A基因甲基化在50歲分界組無統計學意義，但是由于納入文獻的研究的年齡區間不同，分組研究后發現RASSF1A基因甲基化在40歲分界組有統計學意義，即>40歲組RASSF1A基因甲基化表達增加，由于納入的文獻較少，對于RASSF1A基因甲基化與年齡的關系需要大樣本的多中心研究予以證實。

本篇Meta分析有一定局限性，首先，納入的文獻數量有限，缺乏隨機對照試驗，而且普遍質量不高，英文文獻較少。其次，納入的病例對照試驗多為回顧性試驗，相關數據不排除有重疊的可能，這都可能影響分析結果。再者，每一篇文獻的研究年限不一樣，可能導致文獻有異質性，本研究部分指標存在異質性。另一個方面，納入文獻的樣本量不多，其中不是所有的指標都涉及，最終可能導致分析的可靠性降低。最后，本篇Meta分析研究的指標較少，并沒有對RASSF1A基因甲基化與不同類型的甲狀腺癌的相關性進行分析，亦沒有RASSF1A基因甲基化與腫瘤TNM分期的關系進行評估。

1 Swierniak M,Wojcicka A,Czetwertynska M,etal.In-depth characterization of the microRNA transcriptome in normal thyroid and papillary thyroid carcinoma〔J〕.J Clin Endocrinol Metab,2013;98(13):E1401-9.

2 Hughes DT,Haymart MR,Miller BS,etal.The most commonly occurring papillary thyroid cancer in the United States is now a microcarcinoma in a patient older than 45 years〔J〕.Thyroid,2011;21(3):231-6.

3 Galusca B,Dumollard JM,Lassandre S,etal.Global DNA methylation evaluation:potential complementary marker in differential diagnosis of thyroid neoplasia〔J〕.Virchows Arch,2005;447(1):18-23.

4 Kunstman JW,Korah R,Healy JM,etal.Quantitative assessment of RASSF1A methylation as a putative molecular marker in papillary thyroid carcinoma〔J〕.Surgery,2013;154(6):1255-62.

5 徐美榮,陳 云,周紹榮,等.Ras相關區域家族1A半乳糖凝集素3和甲狀腺過氧化物酶mRNA在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達及臨床意義〔J〕.中華腫瘤雜志,2009;31(5):356-60.

6 Nakamura N,Carney JA,Jin L,etal.RASSF1A and NORE1A methylation and BRAFV600E mutations in thyroid tumors〔J〕.Lab Invest,2005;85(9):1065-75.

7 唐建東，賈夏蓮.甲狀腺乳頭狀源組織中NIS和SSF1A基因啟動子區CPG島甲基化狀態的研究〔J〕.中國現代醫學雜志，2010；20(21)：3282-5.

8 王新華,張國昌,劉延玲,等.甲狀腺腫瘤患者Ras相關區域家族1A基因啟動子異常甲基化的檢測〔J〕.陜西醫學雜志,2009;38(7):790-2.

9 瞿 峰,薛萬江.乳頭狀甲狀腺癌組織中RASSF1A基因甲基化及其臨床意義〔J〕.南通大學學報(醫學版),2012;32(6):490-2.

10 彭正良.甲狀腺癌組織中p16和RASSF1A基因甲基化的研究〔D〕.衡陽：南華大學碩士論文，2006.

11 戴亞麗,蔡德鴻,張 樺,等.抑癌基因RAS啟動子甲基化與乳頭狀甲狀腺癌的關系〔J〕.首都醫科大學學報,2011;32(1):135-8.

12 Schagdarsurengin U,Gimm O,Hoang-Vu C,etal.Frequent epigenetic silencing of the CpG island promoter of RASSF1A in thyroid carcinoma〔J〕.Cancer Res,2002;62(13):3698-701.

13 Xing M,Cohen Y,Mambo E,etal.Early occurrence of RASSF1A hypermethylation and its mutual exclusion with BRAF mutation in thyroid tumorigenesis〔J〕.Cancer Res,2004;64(5):1664-8.

14 Santoro A,Pannone G,Carosi MA,etal.BRAF mutation and RASSF1A expression in thyroid carcinoma of southern Italy〔J〕.J Cell Biochem,2013;114(5):1174-82.

15 Dreijerink K,Braga E,Kuzmin I,etal.The candidate tumor suppressor gene,RASSF1A,from human chromosome 3p21.3 is involved in kidney tumorigenesis〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2001;98(42):7504-9.

16 Yee KS,Grochola L,Hamilton G,etal.A RASSF1A poly-morphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma〔J〕.Cancer Res,2012;72(9):2206-17.

17 Mohammadiasl J,Larijani B,Khorgami Z,etal.Qualitative and quantitative promoter hypermethylation patterns of the p16,TSHR,RASSF1A and RARβ2 genes in papillary thyroid carcinoma〔J〕.Med Oncol,2011;28(14):1123-8.

〔2016-04-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

國家自然科學基金(81160019)

胡如進(1962-)，男，碩士生導師，主任醫師，主要從事乳甲外科常見疾病的相關研究。

馬建贏(1986-)，男，碩士，住院醫師，主要從事乳甲外科常見疾病的相關研究。

R604

A

1005-9202(2016)24-6175-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.062

1 南昌大學第二附屬醫院