蘭術四草化濁解毒方對潰瘍性結腸炎大鼠細胞因子水平的影響

李博林 劉啟泉 張 晶 閆丹丹 成亞亞 王志坤

(河北省中醫院,河北 石家莊 050011)

蘭術四草化濁解毒方對潰瘍性結腸炎大鼠細胞因子水平的影響

李博林 劉啟泉 張 晶1閆丹丹1成亞亞1王志坤

(河北省中醫院,河北 石家莊 050011)

目的探討蘭術四草化濁解毒方對潰瘍性結腸炎大鼠細胞因子水平的影響。方法 將60只Wistar大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性藥組、蘭術四草化濁解毒方大、中、低劑量組，每組10只。除空白組外，其余5組制備潰瘍性結腸炎模型。造模后空白組、模型組予蒸餾水灌胃，其余各治療組給予相應藥物灌胃，連續治療2 w。觀察各組大鼠疾病活動指數、結腸黏膜組織病理，血清腫瘤壞死因子(TNF)-α，白細胞介素(IL)-8，IL-10的變化。結果 與模型組比較，蘭術四草化濁解毒方能夠改善結腸黏膜病理變化，減低疾病活動指數評分，降低血清TNF-α及IL-8的含量，升高血清IL-10的含量(P<0.05)。與陽性藥組比較，蘭術四草化濁解毒方大劑量組能夠降低血清TNF-α及IL-8的含量，升高血清IL-10的含量(P<0.05)；蘭術四草化濁解毒方中低劑量組能夠降低血清TNF-α及IL-8的含量(P<0.05)，但血清IL-10含量無顯著差異(P>0.05)。結論 蘭術四草化濁解毒方治療潰瘍性結腸炎的作用機制可能與降低血清TNF-α及IL-8，升高IL-10的含量有關。

蘭術四草化濁解毒方；潰瘍性結腸炎；腫瘤壞死因子-α；白細胞介素-8；白細胞介素-10

潰瘍性結腸炎(UC)其病因和發病機制尚不清楚，可以明確的是在UC的發生發展過程中，免疫因素起了重要作用，而細胞因子則在免疫系統中起著非常重要的調控作用。多種細胞因子及其網絡參與了腸道黏膜炎癥的形成，其中促炎細胞因子和抗炎細胞因子的失衡在UC的發病過程中起了樞紐作用〔1，2〕。課題組前期發現濁毒相干為害貫穿UC發展的全過程，“濁毒內蘊”是本病的主病機〔3〕。以“濁毒”立論的蘭術四草化濁解毒方經臨床驗證顯示出良好療效，本實驗基于平衡細胞因子探討該方的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡Wistar 大鼠60只，雄性，清潔級，體重120～140 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供。動物許可證號：SCXK(冀)2008-1-003,合格證編號：1205036。適應性喂養7 d后進入實驗。

1.2 實驗藥物 蘭術四草化濁解毒方：佩蘭15 g、蒼術6 g、炒白術12 g、茯苓20 g、敗醬草15 g、旱蓮草15 g、豨薟草12 g、仙鶴草20 g、黃連6 g、地榆20 g、佛手12 g、白芍20 g、石榴皮12 g、兒茶6 g 、葛根20 g、當歸6 g。藥物均購自四川新綠色藥業科技發展股份有限公司研發的免煎制劑。上述藥物用90℃以上蒸餾水分別配制成中、低劑量人混懸液：5、2.5、1.25 g/ml。柳氮磺吡啶腸溶片，由上海中西三維藥業有限公司生產，生產批號：20110619，將片劑用研缽研細，過100目篩，溶于蒸餾水中配制成濃度為0.15 g/ml的柳氮磺吡啶混懸液。

1.3 實驗試劑 2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)：由美國Sigma公司生成，批號：2508-19-2。無水乙醇：天津市永大化學試劑有限公司生產。腫瘤壞死因子(TNF)-α放射免疫分析試劑盒：由北京華埠力特生物技術研究所生產。白細胞介素(IL)-8放射免疫分析試劑盒：由北京普爾偉業生物科技有限公司生產。IL-10定量酶聯檢測試劑盒：由上海森雄科技實業有限公司生產。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 正常適應性飼養7 d后，將60只大鼠按照隨機數字表法分為6組，每組10只，分別為空白組(N組)、 模型組(M組)、陽性藥組(SASP組)、 蘭術四草化濁解毒方大劑量組(HD組)、蘭術四草化濁解毒方中劑量組(MD組)蘭術四草化濁解毒方低劑量組(LD組)。

1.4.2 模型制備 采用TNBS/乙醇法誘導UC模型〔3〕。將5%TNBS與50%乙醇以體積1∶1配制成TNBS/乙醇混合液作為造模劑。操作方法:除N組外，其他各組大鼠禁食不禁水24 h后稱體質量，乙醚麻醉，按照4 ml/kg(相當于TNBS100 mg/kg)劑量將造模劑用直徑2 mm的一次性橡膠輸液軟管推入距肛門約8 cm處的腸腔內，提起大鼠尾部，倒置30 s使造模劑充分深入大鼠腸腔，再捏緊大鼠肛門平放10 min左右。造模后大鼠歸籠，常規飼養，自由飲食。3 d后，隨機抽取2只M組大鼠處死，取其結腸標本，病理檢查確認有充血、水腫及典型潰瘍形成等一系列病理變化即為造模成功。造模時HD組、LD組各死亡1只。

1.4.3 給藥途徑和方法 N組、M組予蒸餾水2 ml/kg灌胃；HD組予20 g/kg予大劑量混懸液灌胃；MD組予10 g/kg混懸液灌胃；LD組按予5 g/kg混懸液灌胃；SPAP組予SPAP混懸液,按0.3 g/kg灌胃(相當于成人用藥量的10倍)。各組給藥1次/d,各組連續灌胃14 d。

1.4.4 標本的采集和處理 治療2 w后，停止給藥將大鼠禁食不禁水24 h后，斷頭處死取血，每只取血4 ml，注入試管中待凝固后，4℃ 3 000 r/min離心10 min，分離血漿、血清，置-20℃低溫冰箱保存待檢測。開腹，在距肛門8 cm處取病變部位最明顯處取2 cm標本，放入10%中性甲醛固定24 h后常規脫水、石蠟包埋、HE染色。

1.4.5 觀測指標與檢測方法

1.4.5.1 疾病活動指數(DAI)評分 DAI評分參照文獻〔7〕的標準。

1.4.5.2 結腸黏膜大體觀察及組織病理學觀察 治療結束后，處死大鼠，解剖過程中取大鼠全結腸，生理鹽水沖洗干凈后肉眼觀測結腸黏膜的色澤、充血水腫、糜爛、潰瘍、出血點情況；顯微鏡下觀察結腸組織的病理變化，包括炎性細胞浸潤，腺體結構，黏膜下血管及潰瘍等情況。

1.4.5.3 血清TNF-α、IL-8、IL-10指標檢測 TNF-α、IL-8含量測定：采用放射免疫法檢測。血清IL-10含量測定：采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測，具體方法和操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.5 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行單因素方差分析，SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1 各組大鼠結腸黏膜大體觀與組織病理學觀察 肉眼觀察大鼠結腸黏膜M組最差；HD組黏膜表面光滑，可見少量漿液滲出，皺襞整齊，恢復接近N組；MD組黏膜欠光滑，皺襞比較整齊，可見少許點狀出血區。SASP組和LD組結腸黏膜狀況介于MD組和M組之間,兩組無明顯區別。

在組織病理學方面:N組大鼠結腸黏膜上皮完整，黏膜下血管豐富清晰，腺體排列規則，結構清楚，未見到充血水腫、潰瘍、糜爛點。M組大鼠鏡下潰瘍數量最多，潰瘍面大，組織充血水腫明顯，大部分黏膜缺損，有大量的炎性細胞浸潤，腺體破壞。SASP和LD組仍可見到潰瘍，組織充血水腫較明顯，有較多炎性細胞浸潤。MD組潰瘍較少，潰瘍較淺表，可見部分已愈合的潰瘍組織，輕度組織充血水腫，少量炎性細胞浸潤。HD組潰瘍較少，可見已愈合的潰瘍組織，組織充血水腫不明顯，其基本形態與N組相似。

2.2 各組大鼠DAI評分及血清TNF-α比較 其他各組(除HD組)大鼠血清TNF-α含量均明顯升高，各組DAI評分升高(均P<0.05)。與M組比較，各治療組大鼠血清TNF-α含量及DAI評分均明顯降低(P<0.05)。HD組與MD組、LD組、SASP組比較，能明顯降低大鼠血清TNF-α含量及DAI評分(P<0.05)；與SASP組比較，LD組在降低大鼠血清TNF-α含量及DAI評分上，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

組別nDAITNF?α(ng/ml)N組100 00±0 003)0 55±0 113)M組82 50±0 311)1 30±0 121)SASP組101 57±0 391)2)3)1 14±0 131)2)3)HD組90 37±0 351)2)0 65±0 112)MD組100 80±0 281)2)3)0 82±0 101)2)3)LD組91 44±0 331)2)3)1 02±0 201)2)3)

與N組比較:1)P<0.05；與M組比較:2)P<0.05；與HD組比較:3)P<0.05；下表同

2.3 各組血清IL-8、IL-10比較 與N組比較，其他各組大鼠血清IL-8含量明顯升高，IL-10含量明顯降低(P<0.05)；與M組比較，各治療組大鼠血清IL-8含量明顯降低，IL-10含量均明顯升高(P<0.05)；HD組與MD組、LD組、SASP組比較，能明顯降低大鼠血清IL-8含量，升高大鼠血清IL-10含量(P<0.05)；與SASP組比較，LD組血清IL-8含量的降低與IL-10含量的升高(P>0.05)。見表2。

組別nIL?8(ng/ml)IL?10(pg/ml)N組100 17±0 032)28 02±2 022)M組80 45±0 061)12 80±2 571)SASP組100 39±0 041)2)3)20 81±3 281)2)3)HD組90 27±0 061)2)24 69±4 051)2)MD組100 33±0 051)2)3)19 05±4 691)2)3)LD組90 38±0 071)2)3)17 26±2 001)2)3)

3 討 論

在UC的發病過程中，細胞因子失衡導致免疫失調，是本病發生的關鍵樞紐環節〔4〕。TNF-α是一個多效的炎癥性細胞因子，對腸道上皮細胞增殖和凋亡有重要的調節作用，參與感染、炎癥和自身免疫調節。因TNF-α在T細胞依賴的腸道炎癥中起著重要的促進作用，而成為細胞因子網路中的關鍵因子或禍首因子，并且TNF-α是UC發病的主要炎性啟動因子〔5,6〕。IL-8是多核白細胞移動因子，是一種重要的介導淋巴細胞功能的效應介質，其作用主要是趨化和激活嗜中性粒細胞〔7〕，對中性粒細胞、T細胞、嗜堿性粒細胞均有趨化作用〔8〕。目前認為TNF-α、IL-1、IL-6誘發的炎癥反應很大程度上是通過IL-8為代表的趨化因子所介導的〔9，10〕。IL-10作用主要是抑制致炎因子的釋放和炎癥反應、調節多種免疫細胞的增殖分化〔11〕，是目前公認的抑炎因子。IL-10抗炎活性的關鍵所在是對TNF和IL-1產生的抑制效應，能夠明顯抑制TNF-α的分泌，并且可抑制肥大細胞激活，從而參與變態反應的調節，在維持正常腸道黏膜免疫系統調節中發揮重要作用〔12〕。

以上論述可見UC是以TNF-α為主的炎性因子啟動了病變的過程并參與炎癥細胞相互作用，加重局部腸黏膜炎癥反應；同時刺激相關細胞分泌IL-8，升高的IL-8通過趨化作用，導致組織細胞浸潤，加重腸黏膜炎性損傷，而IL-10則通過抑制炎癥相關因子如TNF-α、IL-8等減輕炎癥反應，降低組織損傷。

潰瘍性結腸炎是西醫病名，依據其臨床表現，中醫將其歸屬于“久痢”、“滯下”、“腸澼”、“腸風”等范疇。筆者認為“濁毒內蘊”是本病的主病機，濁毒相干為害貫穿于UC發展的全過程。本病病位在大腸，與脾胃關系密切，初病多實，久病多虛或虛實夾雜。病機為脾胃失和，運化失職，水濕內停，阻滯氣機，郁而化濁，久而成毒，濁毒久伏，蘊結腸腑，損傷脂膜血絡，則成膿血。病理上呈現痰、濁、瘀、毒互結為害。佩蘭、白術、茯苓、蒼術健脾助運而化濕祛濁，其中佩蘭、蒼術芳香化濁，助白術、茯苓化濕健脾；白術、茯苓益氣健脾化濕，助佩蘭、蒼術運濕化濁。黃連、敗醬草清熱解毒。佛手行氣導滯。仙鶴草、旱蓮草、白芍補虛斂腸。地榆、兒茶、當歸活血祛瘀而止瀉療瘡。石榴皮、葛根清腸止瀉。白芍、當歸養血和血，柔肝止痛，配旱蓮草兼補肝腎。諸藥相合，脾胃健運，水濕得化；肝脾和調，氣機暢利；氣血和暢，痰瘀得消，毒邪得解，而濁毒自愈。

蘭術四草化濁解毒方能夠降低模型大鼠血清TNF-α、IL-8等促炎因子同時提高IL-10等抗炎因子，以達到平衡細胞因子而起到抗炎和調節免疫作用。

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〔2015-07-29修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

國家中醫藥管理局全國名老中醫藥專家傳承工作室建設項目(國中醫藥人教發(2014)20號)；河北省政府重大項目(2014571034)

王志坤(1974-)，女，碩士，主任醫師，教授，主要從事中醫內科學研究。

李博林(1986-)，男，博士，主治醫師，主要從事中醫內科學研究。

R256.3

A

1005-9202(2016)24-6085-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.018

1 河北醫科大學