蛋白酶體抑制劑乳胞素對膠質母細胞瘤U87MG的抑制作用

張揚朱曉波趙金川韓志國孫陽高顯峰王偉柳敬偉侯坤

(吉林大學第一醫院神經外科，吉林 長春 130031)

蛋白酶體抑制劑乳胞素對膠質母細胞瘤U87MG的抑制作用

張 揚 朱曉波 趙金川 韓志國孫 陽 高顯峰 王 偉 柳敬偉 侯 坤

(吉林大學第一醫院神經外科，吉林 長春 130031)

目的 目的 探討蛋白酶體抑制劑乳胞素對人膠質母細胞瘤U87MG的抑制作用。方法 培養人膠質母細胞瘤U87MGM，分別以5、10、15 μmol/L作用于細胞株。MTT 法檢測細胞存活率；bcl-2、Bax及caspase-3 mRNA水平用RT-PCR法檢測；Rh123法檢測線粒體膜電勢；Hoechst 33342檢測細胞凋亡情況；U87MG細胞Bax及bcl-2的蛋白表達用Western印跡法檢測。結果 與未處理組相比對，U87MG細胞在實驗組的存活率下降，bcl-2、Bax mRNA及蛋白表達和線粒體膜電勢均下降，caspase-3 mRNA表達水平上升。結論 在體外條件下，乳胞素對膠質母細胞瘤U87MG細胞具有較強的抑制效應。

蛋白酶體抑制劑；乳胞素；膠質母細胞瘤

膠質瘤是中樞神經系統原發性腫瘤中最高發的類型，約占全部顱內腫瘤的30%，顱內惡性腫瘤的80%〔1〕。據報道，臺灣膠質母細胞瘤患者的中位生存期是15.1個月〔2〕。最大限度的手術切除是新診斷膠質瘤尤其是膠質母細胞瘤最主要的治療手段。手術切除可提供組織學診斷、緩解臨床癥狀和減少腫瘤負荷。然而由于膠質母細胞瘤呈浸潤性生長且常和重要神經結構鄰近，臨床實踐中很難完全切除。所以膠質瘤的正規治療方法應包括一期外科切除和后續放療、化療等在內的綜合治療方案。有文獻提示，手術切除后接受放化療患者的中位生存期可延長10個月〔2〕。

泛素-蛋白酶體途徑是真核生物蛋白降解的重要途徑，對正常細胞周期、細胞功能和細胞存活至關重要。泛素-蛋白酶體途徑代謝障礙可導致腫瘤進展。因此，抑制蛋白酶體途徑的活性是當代惡性腫瘤診療的一個新方向〔3〕。乳胞素(LAC)是一種蛋白酶體抑制劑，與蛋白酶體的催化中心結合，進而達到抑制后者活性的作用。實驗顯示，LAC可誘導大鼠C6和人性膠質細胞瘤(U87MG)細胞凋亡〔4〕。本研究擬進一步明確LAC對人膠質瘤細胞的作用機制及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 上海生工生物工程技術公司提供引物；于TAKARA 公司購買DNA Marker (DL2000)、逆轉錄酶、PCR高保真TaqDNA聚合酶；溴乙錠、四甲基乙二胺(TEMED)、 Lactacystin 、二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(MTT)購于Sigma 公司；Hoechst33342、Rhodamine 123購自北京百奧萊博科技有限公司；在Invitrogen購買Trizol、RT-PCR試劑盒；十二烷基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰胺(PAGE)、N，N-二甲基雙丙烯酰胺、瓊脂糖購于上海寶曼生物科技有限公司；新生牛血清、IMEM購于Gibco 公司。

1.2 分組 分為對照組(Con)和實驗組。實驗組的LAC 濃度分別為5、10、15 μmol/L組。

1.3 MTT 法檢測細胞存活率 以2×104/孔將4組細胞均勻接種在96 孔板中,每組細胞9復孔,分別加入5、10、15 μmol/L濃度的LAC后再培養,然后加入5 g/L的MTT 20 μl，4 h后清除孔中培養基,每個孔加入150 μl DMSO,孔板振蕩直至完全溶解，用BIO-TEK酶標儀檢測每孔的光吸收值。

1.4 采取RT-PCR 法檢測bcl-2、Bax和半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)mRNA 總RNA用Trizol試劑提取，先將總RNA逆轉錄成cDNA，然后取1 μl cDNA用于PCR反應。將磷酸甘油脫氫酶(GAPDH)調平后再擴增目的片段。

用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(GIS)分析擴增產物電泳條帶光密度值，以目的基因和內參磷酸鹽緩沖液GAPDH的比值進行量化分析。

1.5 羅丹明(Rh123)檢測線粒體膜電勢 將細胞鋪于24孔板中，5×104/孔，各種濃度LAC處置細胞后8 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，棄去上清，加上1 μg/ml的Rh123，37℃孵育10～30 min，PBS洗2次，在共聚焦顯微鏡下觀察細胞中熒光強度。

1.6 Hoechst 33342檢測細胞凋亡 將細胞鋪于24孔板中，5×104/孔，各種濃度LAC處置細胞后8 h，PBS洗2次，除上清，加1 μg/ml的Hoechst 33342，37℃孵育20 min，PBS洗2次，顯微鏡下觀察染色質凝集情況及其形態變化。

1.7 Western印跡法檢測U87MG細胞中Bax、bcl-2蛋白的表達水平 LAC處理細胞后倒掉培養液，加入胰酶，離心細胞，PBS洗2遍，各瓶加入150 μl細胞蛋白裂解液，細胞粉碎儀超聲粉碎細胞3次，放入4℃冰箱(約45 min)，離心后上清即為胞質總蛋白，對蛋白進行定量分析，以總蛋白45 μg作SDS-PAGE電泳分離蛋白樣本。濃縮膠100 V 30 min，分離膠200 V 60 min，電泳后以轉膜儀將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上 100 V 80 min，轉膜完畢后5%脫脂處理奶粉封閉2 h,PBST洗4遍,每遍20 min，加入一抗(1∶200)，4℃孵育12 h，PBST洗膜3次(15 min/次),加入過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000～1∶2 000),水平搖床處理40 min。PBST洗3遍(10 min/遍)。加入二氨基聯苯胺(DAB)進行PVDF膜顯色后拍照，內參為β-actin。電泳條帶中以灰度×面積/參照物的值記錄表達的變化。

1.8 統計學方法 應用SPSS16.0軟件行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 MTT檢測U87MG細胞增殖率 與對照組(100%)比較，LAC 5 μmol/L組〔(70.02± 2.3)%〕、LAC 10 μmol/L組〔(65.09±3.5)%〕及LAC 15 μmol/L組〔(55.1± 2.1)%〕中U87MG細胞的增殖率明顯降低(P<0.05)。

2.2 RT-PCR檢測bcl-2/Bax、caspase-3 mRNA表達水平 與對照組比較，LAC 5、10及15 μmol/L組bcl-2/Bax的表達均顯著降低，caspase-3顯著升高(P<0.05)，提示線粒體凋亡途徑可能參與了此過程。見圖1，圖2。

1 Con；2.LAC 5 μmol/L；3.LAC 10 μmol/L；4.LAC 15 μmol/L圖1 各組細胞bcl-2/Bax水平比較

1 Con；2.LAC 5 μmol/L；3.LAC 10 μmol/L；4.LAC 15 μmol/L圖2 各組細胞caspase-3水平比較

2.3 Rh123檢測線粒體膜電勢 與對照組比較，LAC 5、10、15 μmol/L組U87MG細胞內紅色熒光強度明顯減弱，提示線粒體膜電勢明顯減低及細胞凋亡的存在。見圖3。

2.4 Hoechst 33342檢測細胞凋亡 與對照組比較，LAC 5、10、15 μmol/L組U87MG細胞形態發生明顯改變。細胞核皺縮及核分裂普遍存在提示凋亡的發生。見圖4。

圖3 各組細胞線粒體膜電勢比較

圖4 各組細胞核形態比較

2.5 Western印跡電泳檢測bcl-2/Bax蛋白表達水平 與對照組比較，LAC 5、10、15 μmol/L組bcl-2/Bax水平顯著降低(P<0.05)，說明可能有線粒體凋亡的發生。見圖5。

1.Con；2.LAC 5 μmol/L；3.LAC 10 μmol/L；4.LAC 15 μmol/L圖5 各組細胞bcl-2/Bax水平比較

3 討 論

泛素蛋白酶體途徑對細胞蛋白質的有序降解對于信號轉導、轉錄調節、應激反應和受體功能調控至關重要。此途徑控制核因子κB的激活。蛋白酶體在抗原提呈方面也扮演重要角色。罹患癌癥時，這一代謝途徑的失調將導致腫瘤進展、耐藥和腫瘤監控失效。因此，抑制蛋白酶體系統可導致多種調節蛋白失衡，細胞周期停滯和凋亡〔3〕。

蛋白酶體途徑可降解某些轉錄因子、調控蛋白、腫瘤抑制蛋白以及原癌基因。抑制蛋白酶體可引起細胞凋亡。許多研究證實，蛋白酶體抑制劑對惡性、增殖活躍的細胞的作用要比正常細胞敏感。目前已有數種蛋白酶體抑制劑用于腫瘤的基礎研究。如Imajoh-Ohmi等〔5〕證實，作為蛋白酶體β亞基的一種不可逆性抑制劑，LAC可誘導人U937細胞凋亡。

LAC是從鏈霉菌中分離的，具有抑制鼠科動物神經母細胞瘤細胞增殖和誘導軸突分支的作用〔6〕。LAC的抗腫瘤作用主要通過蛋白酶體起作用，而后者廣泛分布于內質網和真核生物細胞核內。蛋白酶體識別并分解已被泛素標記的蛋白。LAC抑制泛素蛋白酶體主要通過細胞色素C依賴性和非依賴性途徑。LAC與26S蛋白酶體的20S核心特異性結合，抑制細胞內肽鏈的降解。LAC對腫瘤細胞具有選擇性蛋白酶體抑制作用。當與化療藥物聯合應用時，它擁有疊加效應，能提高惡性細胞對放、化療的敏感性〔7〕。有實驗顯示，LAC促進c-Myc蛋白穩定化和向胞內集聚，增加Fas-ligand(FasL)的表達，并通過激活caspase-3觸發細胞凋亡〔8〕。蛋白酶體抑制劑理論上可影響正常組織，而LAC中腫瘤細胞具有特異性抑制作用。膠質母細胞瘤具有生長迅速、侵襲性和高度的血管生成作用，因此其蛋白代謝較快且對蛋白酶體系統具有高度依賴性。以上特點使得蛋白酶體抑制劑成為一個理想的治療選擇。

綜上所述，LAC在體外條件下對膠質母細胞瘤U87MG細胞具有較強的抑制作用。然而離臨床應用還有很大一段距離。進一步的動物和人的在體實驗可對其安全性和臨床應用前景進行評估。

1 de Robles P,Fiest KM,Frolkis AD,etal.The worldwide incidence and prevalence of primary brain tumors:a systematic review and meta-analysis〔J〕.Neuro Oncol，2015;17(6):776-83.

2 Chien LN,Ostrom QT,Gittleman H,etal.International differences in treatment and clinical outcomes for high grade glioma〔J〕.PLoS One，2015;10(6):e0129602.

3 Rajkumar SV,Richardson PG,Hideshima T,etal.Proteasome inhibition as a novel therapeutic target in human cancer〔J〕.J Clin Oncol，2005;23(3):630-9.

4 牟 榮，閆 明，劉 威,等.蛋白酶體抑制劑對膠質瘤 U251 細胞增殖的抑制作用〔J〕.中國實驗診斷學，2011;15(2):306.

5 Imajoh-Ohmi S,Kawaguchi T,Sugiyama S,etal.Lactacystin,a specific inhibitor of the proteasome,induces apoptosis in human monoblast U937 cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，1995;217(3):1070-7.

6 Fenteany G,Standaert RF,Lane WS,etal.Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin〔J〕.Science,1995;268(5211):726-31.

7 Legnani FG,Pradilla G,Thai QA,etal.Lactacystin exhibits potent anti-tumor activity in an animal model of malignant glioma when administered via controlled-release polymers〔J〕.J Neurooncol,2006;77(3):225-32.

8 Tani E,Kitagawa H,Ikemoto H,etal.Proteasome inhibitors induce Fas-mediated apoptosis by c-Myc accumulation and subsequent induction of FasL message in human glioma cells〔J〕.FEBS Lett,2001;504(1-2):53-8.

〔2015-12-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

吉林大學第一醫院二部科研專項基金資助(No.B11)

侯 坤(1986-)，男，主治醫師，主要從事神經系統疾病的外科治療研究。

張 揚(1978-)，男，主治醫師，主要從事顱內腫瘤和腦血管疾病的研究。

R651.1+9

A

1005-9202(2016)24-6087-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.019