雞傳染性支氣管炎病毒M41株種毒的凍干鑒定

張敏，蔣桃珍，王靜文，張兵，陳玲

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

雞傳染性支氣管炎病毒M41株種毒的凍干鑒定

張敏，蔣桃珍，王靜文，張兵，陳玲

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

為制備合格的雞傳染性支氣管炎病毒M41株種毒，將M41株毒種接種SPF雞胚進行傳代培養，收獲尿囊液、分裝、凍干，并對凍干毒進行了無菌檢驗、支原體檢驗、剩余水分測定、真空度測定、外源病毒檢驗、病毒含量測定、特異性檢驗、致病性試驗。結果表明，該凍干毒種各項檢驗均符合規定，可作為研究用種毒。本研究可為其他禽源病毒種毒的制備提供借鑒。

雞傳染性支氣管炎病毒；凍干；鑒定

雞傳染性支氣管炎(IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起雞的一種急性高度接觸性呼吸道傳染病，以氣管啰音、咳嗽、打噴嚏，幼雞流鼻涕，產蛋雞產蛋量減少和蛋的品質下降為特征，常因呼吸道、腎臟或消化道感染而引起死亡，本病至今在世界范圍內廣泛流行，給養雞業帶來嚴重危害[1-3]。疫苗免疫是當前預防和控制IB的主要措施[4-7]，IBV M41株不僅用作疫苗制備[8]，而且是《中華人民共和國獸藥典》中規定的疫苗效力檢驗攻毒用標準強毒株[9]。本實驗對中國獸醫微生物菌種保藏中心的IBV M41株進行了擴繁、凍干，并對凍干毒進行了一系列鑒定工作包括性狀、無菌檢驗、支原體檢驗、剩余水分測定、真空度測定、外源病毒檢驗、病毒含量測定、特異性檢驗和致病性試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 IBV M41種毒 CVCC編號為AV1511，購自中國獸醫藥品監察所，置-70 ℃冰箱保存備用。

1.1.2 實驗動物 SPF雞、SPF雞胚均購自北京梅里亞維通動物技術有限公司。

1.1.3 其他材料及試劑 IBV特異性陽性血清、禽網狀內皮組織增生癥病毒(REV)、雞REV特異性抗體、禽白血病病毒(RAV1、RAV2)，中國獸醫藥品監察所；5%蔗糖牛奶、無菌培養基、支原體培養基，中海動物保健科技公司；MEM、胎牛血清，Hyclon公司；禽白血病病毒ELISA試劑盒，IDEXX公司;FITC標記的兔抗雞IgG，sigma公司。

1.2 方法1.2.1 毒種繁殖 將IBV M41種毒用生理鹽水10倍稀釋后尿囊腔接種9日齡SPF雞胚，0.1 mL/枚，37 ℃孵育，每日照蛋，24 h前死胚棄去，24 h后的死胚及時放置于4 ℃冰箱保存。收獲36 h雞胚尿囊液，無菌檢驗合格后作為凍干用毒液，置-70 ℃冰箱保存。

1.2.2 毒種凍干 將病毒尿囊液與無菌檢驗合格的5%蔗糖脫脂牛奶等量混合，分裝于安瓿瓶中，每支1 mL，含病毒0.5 mL，分裝好后立即置于凍干機中凍干，凍干程序為：-40 ℃150 min；-10 ℃660 min；26 ℃ 540 min。凍干結束后將安瓿二次抽真空封口，置-70 ℃冰箱中保存待檢。

1.2.3 毒種鑒定

1.2.3.1 常規檢驗 凍干后毒種按《中華人民共和國獸藥典》抽樣進行鑒定：性狀檢驗應為淡黃色海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解；無菌檢驗應無細菌生長；支原體檢驗應無支原體生長；剩余水分測定和真空度測定應符合規定；外源病毒檢驗應無外源病毒污染。

1.2.3.2 病毒含量測定 抽取待檢樣品用生理鹽水復溶至原體積，然后10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-7四個稀釋度各接種5枚9日齡SPF雞胚，每枚0.1 mL，同時設生理鹽水對照組，置37 ℃培養箱中孵育144 h，每天照蛋，棄去24 h死亡雞胚，記錄24 h后的死胚和雞胚有胎兒發育小、蜷縮等病變數。按Reed-Muench法計算EID50。

1.2.3.3 特異性檢驗 抽取待檢樣品，用滅菌生理鹽水稀釋至200 EID50/0.1 mL, 取1.5 mL與等體積的雞傳染性支氣管炎病毒特異性陽性血清混合，室溫作用1 h(期間振搖1次)，經尿囊腔接種10枚9日齡SPF雞胚，每胚0.2 mL，同時設置病毒對照組和生理鹽水對照組。37 ℃孵育，24 h死亡雞胚棄去不計，觀察24～144 h雞胚存活和胚胎發育情況[8-9]。

1.2.3.4 致病性試驗 取凍干毒1支，用生理鹽水做10倍稀釋后滴鼻、點眼6日齡SPF雞20只，每只0.2 mL，設生理鹽水對照雞10只，每只雞同法接種生理鹽水。所有雞接種后觀察14 d，記錄死亡情況和出現甩頭、伸頸、呼吸困難、流鼻涕等傳染性支氣管炎典型癥狀的情況[8-9]。

2 結果

2.1 性狀檢驗 凍干后病毒呈淡黃色海綿狀疏松團塊(圖1)，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。

圖1 IBV M41凍干毒株

2.2 無菌檢驗 經25 ℃ TG、GA、GP三種培養基和37 ℃ TG、GA兩種培養基檢測發現，IBV M41凍干毒無細菌生長，檢驗合格。

2.3 支原體檢驗 由表1可以看出，IBV M41凍干毒無支原體生長，檢驗合格。

表1 支原體檢驗結果

“-”表示無支原體生長；“+”表示有支原體生長

2.4 剩余水分測定 由表2可以看出，IBV M41凍干毒剩余水分符合規定。

2.5 真空度測定 使用高頻火花真空測定器對凍干毒種進行測定，出現白色、粉色或紫色輝光的判為合格，真空合格的毒種為216支。2.6 外源病毒檢驗 雞胚檢查法尿囊腔和絨毛尿囊膜兩種途徑接種后胎兒發育正常，絨毛尿囊膜無病變，雞胚液血凝試驗結果為陰性;禽白血病病毒檢查結果(表3)和禽網狀內皮組織增生癥病毒檢查結果(圖2)也均為陰性，說明該凍干毒無外源病毒污染。

表2 剩余水分測定結果

表3 禽白血病病毒檢查ELISA試驗結果

S/P值≤0.2判為陰性，S/P值>0.2判為陽性

圖2 網狀內皮組織增生癥病毒檢查結果

2.7 病毒含量測定 結果見表4。IBV M41凍干毒對雞胚的半數感染量為105.9/0.1mL，符合要求。

表4 病毒含量測定結果

2.8 特異性檢驗 結果見表5。可以看出，IBV M41凍干毒的特異性檢驗符合要求。

表5 特異性檢驗結果

2.9 致病性試驗 由表6結果可見，該病毒從第2天起就能引起6日齡SPF雞出現傳染性支氣管炎臨床癥狀，發病癥狀明顯、特異，發病時間集中在第2～7天，至觀察結束，能引起雞群100%發病。

表6 致病性試驗結果

3 討論與小結

凍干后保存是菌毒種最有效的保存方法，保存年限可達15～20年，甚至更長,原理就是使菌毒種在安瓿中冷凍，然后在真空下利用升華現象除去水分，使其處于干燥、缺氧狀態，生理活動停止，在4 ℃即可保存，并且方便存取、運輸、銷售和交換。未經凍干的濕毒即使在超低溫冰箱中保存也存在毒力下降的風險，且不適合運輸，因此很多微生物菌種保藏中心對菌毒種的保藏一般采用凍干保存[10]。

凍干后鑒定是菌毒種保藏前重要的步驟，鑒定不合格的不能作為種毒保存。鑒定不僅要對菌毒種本身特性進行鑒定，也要對其純凈性和凍干后性狀進行判定。本研究對傳染性支氣管炎病毒M41株進行雞胚傳代擴繁后凍干，抽取樣品，經病毒含量測定、純凈性、特異性、致病性、性狀、真空度、剩余水分等鑒定證明，該病毒傳代穩定，病毒含量達到要求；無細菌、支原體和外源病毒污染；能夠被同型特異性陽性血清中和；能引起雛雞100%發病；凍干后性狀、真空度和剩余水分都能達到要求，可以作為研究用種毒。

[1] 童光志.動物傳染病學[M].北京:中國農業出版社,2008.

[2] Saif Y M , Bames H J , Glisson J R,etal.Diseases of poultry[M].11th.Ames:Iow a State University Press, 2003.

[3] Cavanagh D. Coronavirus avian infectious bronchitis virus[J]. Veterinary Research, 2007,38(2):281-297.

[4] Bijlenga G，Cook J K，Gelb J Jr，etal. Development and use of the H strain of avian infectious bronchitis virus from theNetherlands as a vaccine[J]. Avian Pathol，2004，33(6)：550-557.

[5] 陶家權,劉喬然,喬榮芩,等.雞傳染性支氣管炎的流行及防控[J].中國家禽,2009,31(24) : 65-66.

[6] 代金芳.雞傳染性支氣管炎疫苗使用概況[J].畜禽業,2014,12(308):14-15.

[7] 李英芳.雞傳染性支氣管炎流行現狀及其防控措施[J].畜牧獸醫雜志,2015,34(4):88-89.

[8] 農業部獸藥評審中心.獸藥質量標準匯編[S].2011.

[9] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典[S].2010年版三部.

[10]華澤釗.冷凍干燥新技術[M].北京：科學出版社,2006.

(編輯：李文平)

Lyophilization and Identification of Chicken Infectious Bronchitis Virus M41 Strain Seeds

ZHANG Min，JIANG Tao-zhen，WANG Jing-wen，ZHANG Bing，CHEN Ling

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

For the preparation of qualified chicken infectious bronchitis virus M41 strain seeds, M41 strain seeds were inoculated on SPF chicken embryo for subculture. Allantoic fluid was harvested, repackaged andlyophilizated, thensubsequent identification were conducted including the sterility test, mycoplasma test, determination of residual moisture, vacuum degree, exogenous virus test, virus content determination, specific identification and pathogenicity test. All the results show that lyophilizatedseedsmeet the demand of regulation and can be employed for research. This research provides the reference for the preparation of other typespoultry virus of seeds.

chicken infectious bronchitis virus；lyophilization；identification

張敏，碩士，從事動物細胞及病毒方面的研究。E-mail：zmbooksea@163.com

2016-07-05

A

1002-1280 (2016) 08-0005-04

S852.65