柱前衍生化-高效液相色譜法檢測疫苗中游離甲醛含量

馬秋冉，張璐，戴青，楊星，于曉輝

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

柱前衍生化-高效液相色譜法檢測疫苗中游離甲醛含量

馬秋冉，張璐，戴青，楊星，于曉輝*

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

建立了測定疫苗中游離甲醛含量的柱前衍生化-高效液相色譜法。采用2,4-二硝基苯肼衍生疫苗中游離甲醛，乙腈︰水(65︰35)為流動相，流速為1.0 mL/min，色譜柱為Waters Atlantis T3柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測波長為365 nm。在此方法下，3個不同甲醛濃度樣品回收率為98.28%～105.24%，相對標準偏差(RSD)為 2.3%。本方法檢測限為0.4 mg/L，定量限為1.6 mg/L。游離甲醛濃度在0.0040～1.1930 mg/mL范圍內，與甲醛衍生物峰面積呈良好的線性關系(r2=0.9991)。結果表明，該方法分離度高，專屬性強，操作簡單且不易受疫苗基質和顏色影響，可用于測定疫苗中游離甲醛含量。

高效液相色譜；柱前衍生化；甲醛；疫苗

甲醛是一種原生質毒物，對人的神經系統、肺、肝臟均有損害，對皮膚和黏膜有強烈的刺激作用，還是可疑致癌物[1]。在疫苗中常添加甲醛以達到滅活、防腐的目的[2]，《中國獸藥典》對獸用疫苗游離甲醛含量有明確規定[3]。目前常采用乙酰丙酮分光光度法、亞硫酸品紅比色法檢測疫苗中游離甲醛含量。乙酰丙酮分光光度法在應用過程中，抗干擾性差，靈敏度稍低[4]；而亞硫酸品紅比色法，在游離甲醛含量較低時對其難以進行準確測定，并且顯色劑和甲醛標準溶液放置時間長短會對測定結果產生較大影響[5]。因此，本實驗就建立柱前衍生化-高效液相色譜法檢測疫苗中游離甲醛進行了研究，并進行了方法學驗證，以期為測定疫苗中游離甲醛含量提供新方法。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測器PDA2998)；色譜工作站處理軟件Empower 2；Waters Atlantis?T3柱：4.6 mm×250 mm，5 μm；微孔濾膜0.45 μm；分析天平：感量0.01 mg；恒溫水浴鍋；移液器：2～20 μL，Brand公司。

1.2 試劑與試液 甲醛溶液標準品(含量37.0%，批號：141127，天津化學藥品廠)；2,4-二硝基苯肼(2,4-DNPH，批號：20141110，國藥集團化學試劑有限公司)溶液：3.0 g/L，稱取2,4-DNPH約300 mg溶于100 mL乙腈中；中性紅試液：稱取中性紅(批號：20150325，國藥集團化學試劑有限公司)適量，加水制成濃度為0.1%的中性紅溶液；酚紅試液：稱取酚紅適量(批號：F20110616，國藥集團化學試劑有限公司)，加1 mol/L氫氧化鈉制成濃度為0.01%的酚紅溶液；乙腈為色譜純；水為純化水；氫氧化鈉為分析純；雞新城疫疫苗(批號：2015003)；小鵝瘟精制蛋黃抗體(批號：20141001、20141003)；豬圓環病毒2型滅活疫苗(DBN-SX07株)(批號：201503003、2015003-1)；豬支原體肺炎滅活疫苗(批號：2015003-2)。

2 方法與結果

2.1 樣品測定

2.1.1 樣品溶液制備 量取疫苗溶液5.0 mL，置50 mL量瓶中，加20%吐溫-乙醇溶液10 mL，分數次洗滌吸管，洗液并入50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，強烈振搖，靜置，分取下層清液備用，如下層清液不澄清，需經過濾，棄去初濾液，取續濾液，濾液即為樣品溶液。2.1.2 對照品溶液制備 按照所需濃度，精密量取甲醛溶液標準品適量，加水進行稀釋，搖勻；精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，加20%吐溫-乙醇溶液10 mL，再加水稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.1.3 衍生化反應 量取樣品溶液/對照品溶液0.25 mL，置10 mL量瓶中，加3.75 mL水、1.5 mL 2,4-DNPH溶液，再加乙腈稀釋至刻度，搖勻置60 ℃水浴20 min后，待溶液冷卻至室溫，濾過，濾液供HPLC測定。

以保留時間定性，外標法定量，同時做空白試驗，計算疫苗中游離甲醛含量。

2.2 色譜條件 流動相：乙腈︰水(65︰35)；流速1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：365 nm；進樣量為10 μL。

2.3 專屬性考察 將中性紅試液，酚紅試液、甲醛陰性對照溶液(水溶液)、甲醛溶液標準品，按2.1.3項下方法進行衍生化后，按2.2項下方法進行測定，試驗結果見圖1-圖4。結果顯示，按2.2項下的色譜條件，出峰順序依次為2,4-DNPH、甲醛衍生物，且兩者分離度大于1.5。甲醛陰性對照溶液、酚紅試液及中性紅試液色譜圖中，在甲醛衍生物位置不出峰。結果表明該色譜分離條件能夠有效分離2,4-DNPH及甲醛衍生物，且中性紅、酚紅對測定結果無影響，具有較好的專屬性。

2.4 線性關系考察 取甲醛溶液標準品適量，配制濃度為4.9710 mg/mL的甲醛對照品儲備液。分別精密量取甲醛對照品儲備液6.0、5.0、4.0、2.0、0.5、0.2、0.02 mL置25 mL量瓶中加水稀釋至刻度，配制濃度分別為1.1930、0.9942、0.7954、0.3977、0.0994、0.0398、0.0040 mg/mL的甲醛對照品溶液。將不同濃度的甲醛對照品溶液按2.1.3項下衍生化后，按2.2項下方法進行測定。以甲醛衍生物吸收峰峰面積為縱坐標(y)，進樣濃度(x，mg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線(圖5)，計算回收方程為y=8×106+6x+85972，r2=0.9991。試驗表明，游離甲醛在0.0040～1.1930 mg/mL濃度范圍內與甲醛衍生物吸收峰峰面積線性關系良好。

圖1 甲醛溶液標準品色譜圖

圖2 甲醛陰性對照溶液色譜圖

圖3 0.01%酚紅溶液色譜圖

圖4 0.1%中性紅溶液色譜圖

圖5 柱前衍生化-高效液相色譜法測游離甲醛含量線性關系

2.5 準確度考察 取甲醛溶液標準品適量，配制濃度為5.0685 mg/mL的甲醛對照品儲備液。分別量取9份5 mL雞新城疫疫苗供試品溶液，置50 mL量瓶中，加20%吐溫-乙醇溶液10 mL，分數次洗滌吸管，洗液并入50 mL量瓶中，分別加入0.64、0.80、0.96 mL甲醛對照品儲備液，每個濃度3份，加水稀釋至刻度，強烈振搖，靜置，分取下層清液備用，如下層清液不澄清，需經過濾，棄去初濾液，取續濾液。得到甲醛濃度分別為0.0649、0.0811、0.0973 mg/mL的樣品溶液。按2.1.1項下方法，平行制備2份雞新城疫疫苗樣品溶液，作為空白樣品溶液。將上述11份樣品溶液，按2.1.3項下方法衍生化后，按2.2項下方法進行測定，每個樣品重復測定2次，計算加樣回收率、平均回收率及RSD值。試驗結果見表1。

2.6 檢測限、定量限考察 取甲醛溶液標準品適量，配制濃度為100 μg/mL的甲醛對照品儲備液。分別精密量取5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.5 mL甲醛對照品儲備液置50 mL量瓶中加水稀釋至刻度，配制濃度為10、8、6、4、2、1 μg/mL的甲醛對照品溶液。按2.1.3項下方法衍生化后，按2.2項下方法進行測定。測定結果顯示，濃度為1 μg/mL時，游離甲醛衍生物的信噪比(S/N)約等于3；濃度為4 μg/mL時，游離甲醛衍生物的信噪比(S/N)>10。確定本方法的檢出限為0.4 mg/L，定量限為1.6 mg/L。

表1 柱前衍生化-HPLC法檢測疫苗中游離甲醛含量準確度試驗數據

2.7 樣品測定 取5批獸用疫苗，按2.1項下測定方法進行檢測，計算樣品中游離甲醛含量，結果見表2。5批獸用疫苗的游離甲醛含量均符合2010年版《中國獸藥典》規定，均不高于0.8 mg/mL。

表2 5批獸用疫苗游離甲醛含量的測定結果

3 討論與小結

3.1 衍生化反應體系的優化 紀宏等[5]曾采用稀鹽酸溶解2,4-DNPH，王連珠等[6-7]采用乙腈溶解,但陳笑梅等[8]發現甲醛與2,4-DNPH在弱酸緩沖溶液中反應結果不穩定，并有2,4-DNPH晶體析出。經試驗發現，當2,4-DNPH為3.0 g/L時，在稀鹽酸溶液中不能完全溶解，但易溶于乙腈，故本研究采用乙腈溶解2,4-DNPH。

3.2 2,4- DNPH用量的選擇 當甲醛濃度為1 mg/mL時，甲醛衍生物峰面積隨2,4-DNPH加入量的增加而增加。當加入量為1.5～2.5 mL時，甲醛衍生物吸收峰峰面積基本一致，說明甲醛已反應完全。本試驗選用3 mg/mL 2,4-DNPH溶液1.5 mL進行衍生化反應。

3.3 小結 本實驗建立了柱前衍生化-高效液相色譜法檢測疫苗中的游離甲醛含量，該方法分離效率高，選擇性好，操作簡單且不易受疫苗中基質和顏色影響，可用于疫苗中游離甲醛含量的測定。

[1] 都麗萍，梅丹. 免疫接種的安全性及不良事件[J] .藥物不良反應雜志,2010, 12(4)：255-261.

[2] 趙鎧，章以浩，李河民. 醫學生物制品學[M].2版.北京：人民衛生出版社，2007: 805-816.

[3] 中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典 [M]. 三部. 北京：中國農業出版社，2010: 附錄20.

[4] 李忠軍，鄒訓重，黎彧，等. 甲醛測定方法的進展概述[J]. 廣東微量元素科學，2014, 21(6): 28-32.

[5] 紀宏，馬迅，祁進，等. 衍生毛細管氣相色譜法測定流感病毒裂解疫苗中游離甲醛含量[J]. 中國生物制品學雜志，2014, 27(8): 1097-1102.

[6] 王連珠，王登飛，梁鳴，等. 高效液相色譜法測定化妝品中甲醛[J]. 理化檢驗：化學分冊，2006, 42(9): 723-725.

[7] SN/T 1547-2005. 進出口食品中甲醛含量測定-液相色譜法[S].

[8] 陳笑梅，施旭霞，朱衛建，等. 高效液相色譜直接測定甲醛衍生物反應條件的研究[J]. 分析化學，2004, 32(11): 1489-1491.

(編輯：李文平)

Determination of Free Formaldehyde Content in Vaccine by Pre-column Derivatization HPLC

MA Qiu-ran, ZHANG Lu, DAI Qing, YANG Xing, YU Xiao-hui*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

Pre-column derivatization HPLC method was established in order to determine the free formaldehyde content in vaccine with 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) as the derivatization reagent. The Waters Atlantis T3 (4.6 mm×250 mm, 5 μm) was used in the analysis. The mobile phase was a mixture of acetonitrile and water with a ratio of 65 to 35 by volume. The flow rate was 1.0 mL/min. UV detection was made at the wavelength of 365 nm. The recovery of samples was in a range of 98.28%～105.24%, with relative standard deviation (RSD) of 2.3%. The detection limit was 0.4 mg/L and the quantitation limit was 1.6 mg/L. The free formaldehyde content in vaccine showed good liner relationship to the peak area within a content range of 0.0040～1.1930 mg/mL (r2=0.9991). This method is separable, specific, simple and not easy to be affected by vaccine’s ground substance and color, and might be used for determination of formaldehyde content in vaccine.

HPLC; pre-column derivatization; free formaldehyde; vaccine

馬秋冉，碩士，從事化學藥品檢驗檢測工作。

于曉輝。E-mail：yuxiaohui@ivdc.org.cn

2016-06-20

A

1002-1280 (2016) 08-0020-04

R927.2