酶聯免疫吸附分析法測定豬、雞糞便中11種β2-受體激動劑殘留的不確定度評定

周悅榕，李丹妮，顧欣，吳劍平，嚴鳳，潘娟，張婧

(上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103)

酶聯免疫吸附分析法測定豬、雞糞便中11種β2-受體激動劑殘留的不確定度評定

周悅榕，李丹妮，顧欣，吳劍平，嚴鳳，潘娟，張婧

(上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103)

以市售β2-受體激動劑酶聯免疫檢測試劑盒為基礎，對采用酶聯免疫吸附分析法測定豬、雞糞便中11種β2-受體激動劑殘留的不確定度進行評估，找到影響不確定度的主要因素，為控制實驗過程和評價檢測結果可靠性提供依據。本研究對標準溶液配制、樣品稱量、樣品前處理過程、樣品添加回收率、酶聯免疫吸附分析測試程序、酶標儀吸光度示值誤差等測量不確定度來源進行了分析，通過評定各不確定度分量與不確定度大小，得到豬、雞糞便中11種β2-受體激動劑擴展不確定度的范圍分別在0.25～2.4 ng/g和0.42～1.7 ng/g范圍內。由各因素對合成不確定度貢獻比的分析可知，標準溶液配制、樣品前處理過程、樣品添加回收率、酶聯免疫吸附分析測試程序、酶標儀吸光度示值誤差是主要的影響因素。通過合理地控制各影響因素有利于提高檢測結果的準確性與可靠性。

不確定度；β2-受體激動劑；酶聯免疫吸附分析法；豬糞便；雞糞便

β2-受體激動劑是一組選擇性β2-腎上腺素受體激動劑，俗稱“瘦肉精”。因其具有高選擇性與蛋白同化作用，能減少動物體內脂肪形成，顯著提高瘦肉率。故該藥物被非法用于畜牧生產以促進家禽生長和改善肉質[1]。人體攝入含高殘留的動物源性食品會出現頭暈、心悸、手指震顫等中毒癥狀[1]。我國農業部陸續出臺了農業部176號公告[2]、193號公告[3]、235號公告[4]、1519號公告[5]等法律法規以遏制β2-受體激動劑在動物飼養環節中的違法使用。

近年來，糞便樣品作為獸藥殘留檢測的新載體受到了科研人員的廣泛關注[6-7]。本實驗室前期在市售β2-受體激動劑酶聯免疫檢測體系的基礎上建立了一套快速簡便的豬、雞糞便中11種β2-受體激動劑多殘留的酶聯免疫吸附篩查方法[8]。為提供更科學、更完整的檢測結果，測量不確定度受到了檢測人員的高度重視。本文根據JJF 1059.1-2012 《測量不確定度評定與表示》[9]和CNAS GL06-2015《化學分析中不確定度的評估指南》[10]對本實驗室建立的測定豬、雞糞便中11種β2-受體激動劑的方法進行不確定度評定，以期找出影響檢測結果不確定度的主要因素，為檢測過程的控制以及檢測結果的質量評估提供理論基礎和科學依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

1.1.1 標準品 沙丁胺醇(Salbutamol，純度 99.7%，批號：100204-201103)購自中國食品藥品鑒定研究院。溴布特羅(Brombuterol，純度>99 %，批號：080415)、鹽酸馬布特羅(Mabuterol Hydrochloride，純度>99.5 %，批號：120805)、醋酸卡布特羅(Carbuterol Acetate，純度>98.5 %，批號：261533)、鹽酸馬噴特羅(Mapenterol Hydrochloride，純度≥ 99 %，批號：061005)、醋酸吡布特羅(Pirbuterol Acetate，純度>99.9 %，批號：241741)、西馬特羅(Cimaterol，純度>99 %，批號：071105)、西布特羅(Cimbuterol，純度>99.6 %，批號：241418)、克侖潘特鹽酸鹽(Clenpenterol Hydrochloride，純度>99.5 %，批號：241840)均購自witega公司。鹽酸克侖特羅(Clenbuterol Hydrochloride，純度 98.5%，批號：20223)、硫酸特布他林(Terbutalin Sulfate，純度 98.5 %，批號：10331)均購自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

1.1.2 試劑 β2-受體激動劑酶聯免疫試劑盒(批號：269534，英國朗道實驗診斷有限公司)；氫氧化鈉、鹽酸(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)；甲醇 (色譜純，美國Merck公司)；實驗用水均為一級水。

1.1.3 標準貯備液的配制 分別精密稱取11種β2-受體激動劑標準品含藥物質量為0.01 g(精確至0.00001 g)，用適量甲醇溶解并定容至10 mL，配制成含藥物濃度各為1 mg/mL的標準儲備液，置于4 ℃冷藏保存，有效期6個月。

1.2 儀器與設備 BioTek ELX808 酶標儀(帶450 nm波長濾光片，美國伯騰儀器公司，美國)；BioTek Gen 5.0TM數據分析軟件(美國伯騰儀器公司，美國)；PL202-L感量為0.01 g電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，上海)；AB135-S感量為0.00001 g電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，上海)；BOD-10低溫恒溫培養箱(REVCO公司，美國)；AllegraTMX-22R Centrifuge高速冷凍離心機(美國BECKMAN COULTER公司，美國)；KS-260漩渦振蕩器(德國IKA公司，德國)；MILLIPORE A10超純水系統(密理博(上海)貿易有限公司，上海)；TARGIN VX-Ш多管渦旋振蕩器(北京踏棉科技有限公司，北京)。

1.3 樣品 本實驗所使用的豬、雞糞便樣品源于上海市奉賢區某養殖場的隨機抽樣。經本實驗室前期開發的畜禽糞便中β2-受體激動劑液相色譜-串聯質譜檢測法確證為β2-受體激動劑類藥物陰性。

1.4 方法

1.4.1 樣品前處理步驟 稱取豬、雞糞便樣品(2 ± 0.01) g于50 mL離心管中，準確加入20 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液提取，充分混勻，振蕩10 min，離心5 min (9000 r/min)。取出全部提取液于另一支50 mL離心管中，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調節樣液的pH值范圍為7～9，離心5 min (9000 r/min)，取50 μL上清液供β2-受體激動劑的酶聯免疫試劑盒檢測。

1.4.2 試劑盒檢測步驟 參見英國朗道實驗診斷有限公司β2-受體激動劑酶聯免疫試劑盒產品說明書。

1.4.3 不確定度來源的分析 根據1.4.1項樣品前處理步驟和1.4.2項試劑盒檢測步驟分析，測定豬、雞糞便中11種β2-受體激動劑殘留不確定度的來源包括：標準溶液配制引入的不確定度 urel(C)；樣品稱量引入的不確定度 urel(Mspl)；樣品前處理過程引入的不確定度 urel(Aspl)；樣品添加回收率引入的不確定度 urel(Rspl)；酶聯免疫吸附分析測試程序引入的不確定度 urel(EELISA)；酶標儀吸光度示值誤差引入的不確定度 urel(E酶標儀)。

2 結果與分析

2.1 標準溶液引入的不確定度 urel(C)

根據前文對于霍童古鎮旅游者的構成及出游動機和需求項目的分析，人們更傾向于參與具有民俗特色和度假性質的旅游活動，因此霍童古鎮應主要著眼于開發和推進“二月二燈會”、霍童線獅表演、杜木沖浪等民俗項目，著力打造“霍童古鎮二月二燈會節”節慶活動，增強游客的參與度，使其置身其中，獲得良好的旅游體驗。

表1 11種β2-受體激動劑標準品純度引入的相對標準不確定度

故由配制標準貯備液引入的合成標準不確定度uc(Cstd)=[0.00152+0.000202]1/2=0.0015 mL，其相對標準不確定度urel(Cstd)=0.0015 mL/10 mL=0.00015。

2.1.4 標準中間液配制引入的不確定度urel(Cmid) 分別精密移取適量1.1.3項含藥物濃度均為1 mg/mL的標準貯備液，用甲醇分步稀釋并定容至10 mL，配制成含藥物濃度各為100 ng/mL的11份標準工作液，標準工作液須臨配現用。

根據上述標準工作液配制步驟可知，標準工作液配制的稀釋因子為f10-0.1=(V10/V0.1)=100。根據上海校正技術檢測有限公司提供的校準證書，100 μL移液器的相對擴展不確定度為Urel-100μL移=0.7%(k=2)。10 mL A級容量瓶的擴展不確定度U10 mL容=0.003 mL(k=2)。故由100 μL移液器體積引入的相對標準不確定度urel(V100 μL移)=0.007/2=0.0035，其標準不確定度u(V100 μL移)=0.0035×0.1 mL=0.00035 mL；由10 mL容量瓶體積引入的標準不確定度u(V10 mL容)=0.003 mL/2=0.0015 mL，其相對標準不確定度urel(V10 mL容)=0.0015 mL/10 mL=0.00015。則u(f100)/f100={[u(V100μL移)/0.1]2+[u(V10mL容)/10]2}1/2={[urel(V100μL移)]2+[urel(V10mL容)]2}1/2=(0.00352+0.000152)1/2=0.0035，故由標準中間液配制引入的相對標準不確定度urel(Cmid)=(0.00352+0.00352)1/2=0.0049，其標準不確定度u(Cmid)=0.0049×100 ng·mL-1=0.49 ng·mL-1。

因此，11種β2-受體激動劑標準溶液配制引入的相對標準不確定度由urel(Pstd)、urel(Mstd)、urel(Cstd)、urel(Cmid)合并而成。故由11種β2-受體激動劑標準溶液配制引入的相對標準不確定度如表2所示。

表2 11種β2-受體激動劑標準溶液配制引入的相對標準不確定度

2.2 樣品稱量引入的不確定度urel(Mspl) 按照1.4.1項確定的樣品前處理步驟稱取糞便樣品2.00 g。根據上海市計量測試技術研究院提供的梅特勒-托利多PL202-L(d=0.01 g,e=0.1 g)天平檢定證書：(1)當m∈[0,50] g時，天平示值誤差檢定結果為0.0 g；(2)天平重復性檢定結果為0.0 g。故由樣品稱量引入的合成標準不確定度uc(Mspl)=0.00 g，其相對標準不確定度urel(Mspl)=0.0 g/2.00 g=0.00。因此，樣品稱量引入的不確定度可忽略不計。

2.3 樣品前處理過程引入的不確定度urel(Aspl)

2.3.1 單標線吸量管體積的校準 按照1.4.1項確定的樣品前處理步驟吸取糞便樣品提取液20.0 mL。根據上海校正技術檢測有限公司提供的校準證書，實驗用20 mL A級單標線吸量管的擴展不確定度U20 mL吸=0.002 mL(k=2)，故由20 mL A級單標線吸量管的標準不確定度u(V20 mL吸)=0.002 mL/2=0.001 mL，其相對標準不確定度urel(V20 mL吸)=0.001 mL/20 mL=0.00005。

故由樣品前處理過程引入的合成標準不確定度uc(Aspl)=[0.0012+0.00732]1/2=0.0074 mL，其相對標準不確定度urel(Aspl)=0.0074 mL/20 mL=0.00037。

表3 豬、雞糞便樣品添加回收率引入的不確定度和顯著性檢驗t值(n=6)

2.5 酶聯免疫吸附分析測試程序引入的不確定度urel(EELISA)

2.5.1 移液器加樣引入的不確定度urel(V50μL加樣)

2.5.1.2 移液器充液重復性變化分量[14]本實驗使用100 μL移液器的50 μL檔位進行酶聯免疫試劑盒加樣操作。根據上海校正技術檢測有限公司提供的校準證書，100 μL移液器50 μL檢定點的重復性為0.8%，故由移液器充液重復性變化引入的相對標準不確定度為0.0080。

故由移液器加樣引入的相對標準不確定度urel(V50μL加樣)=[0.00922+0.0082+0.000362]1/2=0.012。

2.5.2 培養箱溫度變化所引入的不確定度urel(E培養箱) 本實驗采用了REVCO公司BOD-10低溫恒溫培養箱。根據上海市計量測試技術研究院提供的酶標儀校準證書，培養箱溫度校準結果的擴展不確定度為U培養箱=0.4 ℃(k=2)。故由培養箱溫度變化引入的標準不確定度：u(E培養箱)=0.4 ℃/2=0.20 ℃，其相對標準不確定度為urel(E培養箱)=0.20 ℃/25 ℃=0.0080。

因此，由酶聯免疫吸附分析測試程序引入的相對標準不確定度urel(V50μL加樣)和urel(E培養箱)合并而成。故由酶聯免疫吸附分析測試程序引入的相對標準不確定度為urel(EELISA)=[0.0122+0.00802]1/2=0.014。2.6 酶標儀吸光度示值誤差引入的不確定度urel(E酶標儀) 本實驗采用美國伯騰儀器公司BioTek ELX808酶標儀(帶450 nm波長濾光片)。根據上海市計量測試技術研究院提供的培養箱校準證書，酶標儀校準結果的擴展不確定度為U酶標儀=0.012A(k=2)，酶標儀校準用中性濾光片的標稱值為1.0A。故由酶標儀示值誤差引入的標準不確定度：u(E酶標儀)=0.012A/2=0.0060A，其相對標準不確定度urel(E酶標儀)=0.0060A/1.0A=0.0060。

2.7 合成標準不確定度 分析各不確定度分量對合成不確定度的貢獻比見表4。

表4 各不確定度分量對合成標準不確定度的貢獻比(%)

根據表9數據將各相對標準不確定度合成，得到豬、雞糞便樣品中11種β2-受體激動劑殘留的相對合成標準不確定度見表5。

表5 豬、雞糞便樣品中11種β2-受體激動劑殘留的相對合成標準不確定度

2.8 擴展不確定度Urel(X) 在95%包含概率下，取包含因子k=2，得到豬、雞糞便樣品中11種β2-受體激動劑殘留的相對擴展不確定度見表6和表7。

表6 豬糞便樣品中11種β2-受體激動劑殘留的相對擴展不確定度(ng/g)

表7 雞糞便樣品中11種β2-受體激動劑殘留的相對擴展不確定度(ng/g)

2.9 不確定度的報告 酶聯免疫吸附分析法測定豬、雞糞便中11種β2-受體激動劑殘留結果見表8。

表8 豬、雞糞便樣品中11種β2-受體激動劑殘留檢測的結果報告(ng/g)

3 討論與小結

3.2 各不確定度分量對合成標準不確定度貢獻比的分析 在不確定度評定過程中，各不確定度分量對合成標準不確定度的影響程度各異。故通過分析各不確定度分量對合成標準不確定度貢獻比為確定影響實驗不確定度的主導因素提供了依據，有助于實驗人員對實驗過程的有效控制、提高檢測結果的質量。由表4數據可知，本實驗的各不確定度分量中標準溶液配制、樣品添加回收率、酶聯免疫吸附分析測試程序、酶標儀吸光度示值誤差引入的不確定度對合成標準不確定度的影響較大，樣品前處理過程引入的不確定度對合成標準不確定度的影響較小，樣品稱量引入的不確定度對合成標準不確定度可忽略不計。

3.3 相對標準不確定度一覽表 本實驗涉及對多個不確定度分量的評定，故采用列表形式直觀地反映各不確定度分量與數值大小，用于不確定度評定過程中的快速查閱。因此，各不確定度來源引入的相對標準不確定度見表9。

表9 相對標準不確定度一覽表

本研究在現有的市售β2-受體激動劑酶聯免疫檢測體系基礎上，評定了酶聯免疫吸附分析法測定豬、雞糞便中11種β2-受體激動劑殘留[8]的不確定度。著重分析了各不確定度分量、大小以及其對總不確定度的貢獻比，與同類研究不同的是本研究采用樣品添加回收率數值代替傳統評估中單一使用方法檢測結果進行不確定度A類評定，這樣既考察了檢測結果的分散性，又考察了樣品中目標化合物的回收率確保了檢測結果的準確度以及不確定度評定的規范性和有效性。據此，得到本次測定中影響不確定度的主要來源是標準溶液配制、樣品前處理過程、樣品添加回收率、酶聯免疫吸附分析測試程序、酶標儀吸光度示值誤差。因此，欲降低本實驗測定結果的不確定度可選用純度高且溯源性強的有證標準物質，調整標準溶液的配制程序；不斷改善樣品前處理步驟，優化實驗回收率；加強實驗過程控制和強化實驗基礎規范性(如：實驗溫度的保證、人員操作與儀器的使用規范等)。本文通過不確定度評定了解了對該項目測定結果影響較大的各不確定度分量，為進一步改善實驗操作規范和提高檢測結果質量提供了參考依據。

[1] 方曉明,丁卓平. 動物源食品獸藥殘留分析[M]. 北京:化學工業出版社,2009：306-308.

[2] 中華人民共和國農業部176號公告. 禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄[S].

[3] 中華人民共和國農業部193號公告. 食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單[S].

[4] 中華人民共和國農業部235號公告. 動物性食品中獸藥最高殘留限量[S].

[5] 中華人民共和國農業部1519號公告. 禁止在飼料和動物飲水中使用的物質[S].

[6] 王麗,鐘冬蓮,陳光才, 等. 固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法測定畜禽糞便中的殘留抗生素[J]. 色譜, 2013, 31(10): 1010-1015.

[7] 李丹妮,嚴鳳,吳劍平, 等. 在線凈化液相色譜-串聯質譜法測定畜禽糞便中7種β2-受體激動劑[J]. 分析化學,2014,42(12):1797-1803.

[8] 周悅榕,李丹妮,顧欣,等. 酶聯免疫吸附分析法測定豬、雞糞便中11種β2-受體激動劑殘留[J]. 中國獸藥雜志,2015,49(8):39-45.

[9] JJF1059.1-2012. 測量不確定度評定與表示[M]. 北京：中國計量出版社, 2012.

[10]CNAS GL06-2015. 化學分析中不確定度的評估指南[S].

[11]王蓓,張鑫,顧欣,等. 液相色譜法測定豬雞可食性組織中四環素類殘留量的不確定度評估[J]. 中國獸藥雜志,2010,44(11):8-11.

[12]周煒,應永飛,韋敏玨,等. 液相色譜-串聯質譜法測定動物尿液中11種β-受體激動劑殘留量的不確定度評估[J]. 中國獸藥雜志,2013,47(6):44-49.

[13]官詠儀,邱志超,宋陽,等. 高效液相色譜法測定葡萄酒中山梨酸含量的不確定度評定[J]. 食品科學,2015,36(16):231-235.

[14]黃雪英,齊敏,沈丹,等. 液質聯用法測定豬肝中β-受體激動劑殘留的不確定度評定[J]. 中國獸藥雜志,2015,49(1):48.

[15]耿維明. 測量誤差與不確定度(第二版)[M]. 北京:中國質檢出版社, 2015:229.

(編輯：侯向輝)

Evaluation on Uncertainty of Measurement in Determination of 11 β2-Agonists Residue in Swine and Chicken Manure by Enzyme Linked Immunosorbent Assay

ZHOU Yue-rong, LI Dan-ni, GU Xin, WU Jian-ping,YAN Feng, PAN Juan, ZHANG Jing

(ShanghaiAnimalDiseaseControlCenter,Shanghai201103,China)

The uncertainty of measurement in determination of 11 β2-agonists residue in swine and chicken manure by ELISA, in accordance with commercial β2-Agonist-Testing kit, was evaluated, which was to provide reliable evidence for finding the main factors for the final uncertainty, controlling experiment process as well as estimating the reliability of results. The main factors of the research, containing preparation of standard solution, weighing of sample, sample pretreatment, recovery of spiked samples, ELISA-testing procedure and indication error of absorbance in enzyme mark instrument were analyzed. The expanded uncertainty was ultimately obtained by means of synthesizing various uncertainty components and evaluating the value as well. The expanded uncertainty of 11 β2-agonists residue in swine manure was in the range of 0.25～2.4 ng·g-1, and the expanded uncertainty of 11 β2-agonists residue in chicken manure was in the range of 0.42～1.7 ng·g-1. Preparation of standard solution, sample pretreatment, recovery of spiked samples , indication error of absorbance in enzyme mark instrument were main factors to the final uncertainty in accordance with the contributions of all components. In short, the accuracy and reliability could be improved by reasonable control of each influence factor.

uncertainty; β2-agonist; ELISA; swine manure; chicken manure

上海市市級農口系統青年人才成長計劃 [滬農青字(2014)第2-2號]

周悅榕，助理畜牧師，從事獸藥殘留檢測與方法開發。E-mail: zhou_yuerong@qq.com

2016-06-30

A

1002-1280 (2016) 08-0024-09

S859.84