胃癌組織miR-155的表達及其與臨床預后的關系

周 明， 馬建明

揚州市第一人民醫院普通外科， 揚州 225001

論 著

胃癌組織miR-155的表達及其與臨床預后的關系

周 明， 馬建明*

揚州市第一人民醫院普通外科， 揚州 225001

目的：探討胃癌組織miR-155的表達水平及其臨床意義。方法：收集手術切除的胃癌標本116例，采用實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測癌及癌旁組織miR-155的表達水平，分析其與臨床病理的關系及對臨床預后的影響。采用免疫組織化學法檢測癌組織中PTEN的表達，分析其表達與miR-155的相關性。結果：胃癌組織miR-155表達高于配對癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.001)；miR-155高表達與腫瘤TNM分期、侵犯層次、淋巴結轉移有關(P<0.05)。K-M曲線分析表明，miR-155高表達預示著較低的3年無病進展率(P<0.001)及總生存率(P<0.001)。PTEN表達與miR-155負相關，miR-155高表達患者PTEN表達低(P<0.001)。結論：miR-155與胃癌發生發展密切相關，可能是胃癌潛在的臨床診斷及預后指標。

胃癌；miR-155；PTEN；臨床意義；預后

胃癌在我國發病率、死亡率較高，嚴重威脅國人的生命健康，但目前發病機制仍未完全明確[1-3]。微小RNA(miRNAs)在調控腫瘤發生、侵襲及轉移等多個環節發揮重要作用，可能是腫瘤臨床診治新的靶點，成為目前腫瘤精準醫學研究的熱點。既往研究[4-7]表明：miR-155在包括結直腸癌、乳腺癌在內的多種惡性腫瘤中高表達，且與腫瘤的發生發展密切相關。因此，本研究采用實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)技術檢測胃癌組織miR-155的表達，并分析其與胃癌患者臨床預后間的關系，探討其在胃癌發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2010年7月至2013年4月揚州市第一人民醫院普通外科手術切除的胃癌標本116例。每例標本均配對距腫瘤5 cm以上的癌旁組織。手術標本離體后，5 min內無菌取材并迅速存放在液氮，于-80℃冰箱中保存?；颊甙行?6例，女性70例；年齡 37～83歲，平均(59±3)歲。入選標準：經病理確診的原發性胃癌患者，術前未行放化療；患者及家屬配合，并簽署知情同意書，愿意提供臨床隨訪資料。排除標準：術前行新輔助化療；病理確定為轉移性胃癌。本研究通過醫院醫學倫理委員會審核。

1.2 組織總RNA的提取及反轉錄反應 胃癌組織及癌旁組織總RNA的提取采用RNA提取試劑盒(美國LC Science公司)，按照試劑盒說明書操作。瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA的完整性。miR-155莖環反轉錄反應引物為5′-CGC TGC TAC CTG AGA GTA GAC CAG ATG CAG CGA CCC CT-3′，由上海博仕生物服務公司設計合成。應用反轉錄試劑盒(上海博仕生物服務公司)配制10 μL反轉錄體系，反應條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s，反應結束后放-20℃保存。

1.3 Real-time PCR檢測miR-155的表達 引物由上海博仕生物服務公司設計合成，miR-155上游引物：5′-TTA ATG CTA ATC GTG ATA G-3′，下游引物：5′-ACC TGA GAG TAG ACC AGA-3′；內參U6上游引物：5′-CTT CGG CAG CAC ATA TAC TAA AAT-3′，下游引物：5′-CAG GGG CCA TGC TAA ATC TTC-3′。應用SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)配制25 μL PCR反應體系，反應條件為：94℃ 3 min預變性后，94℃ 30 s，45℃ 30 s，72℃ 30 s；35個循環。所有反應設2個復孔。記錄每個反應管中的熒光信號達到所設立閾值時所經歷的循環數(即Ct值)，將原始數據取2次重復的平均值后，用內參基因進行歸一化，分別計算癌組織及配對癌旁組織中的miR-155的相對表達量。

1.4 免疫組化法檢測PTEN的表達 將所有患者胃癌病理標本制作4 μm厚度病理切片，嚴格按照GeneTech的EnVision免疫組化試劑盒說明書進行S-P法免疫組化染色。每張免疫組化切片在光鏡下隨機取3個視野拍照保存后，根據染色強度和陽性細胞百分率對免疫組化結果進行半定量分析。由2位病理科醫師獨立進行免疫組化染色評分后取均值。染色強度評分如下：未著色者計0分，著色淺者計1分，中度著色者計2分，強著色者計3分。陽性細胞百分率評分如下：陰性者計0分，陽性細胞數≤10%者計1分，11%～50%者計2分，51%～80%者計3分，≥80%者計4分。每張切片計分=染色強度×陽性細胞百分率。

1.5 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件分析。用Kolmogorov-Smirnov檢驗分析每組數據是否符合正態分布。數據均以中位數(四分位數)表示。采用非參數Wilcoxon符號秩和檢驗分析胃癌組織和配對癌旁組織miR-155表達差異。用Mann-WhitneyU檢驗和Kruskal-Wallis檢驗分析miR-155表達水平與胃癌臨床各病理參數之間的關系。生存曲線用Kaplan-Meier(K-M曲線)方法創建，并用Log-rank方法檢驗。PTEN的表達和miR-155表達的相關性采用Pearson相關分析。檢驗水準(α)為0.05。

2 結 果

2.1 胃癌及癌旁組織中miR-155的表達差異 結果(圖1)表明：癌組織miR-155的表達水平高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.001)。

圖1 胃癌與癌旁正常組織中miR-155的表達差異

2.2 胃癌組織miR-155表達水平與患者臨床病理特征的關系 結果(表1)表明：胃癌組織miR-155表達水平與侵犯層次、TNM分期、淋巴結轉移明顯相關(P<0.05)，高表達miR-155患者較低表達患者有較深的腫瘤浸潤深度、較高的TNM分期及較多的淋巴結轉移，而與性別、年齡、腫瘤大小及脈管侵犯無明顯相關。

2.3 胃癌組織miR-155表達與胃癌患者臨床生存之間的關系 本研究限定36個月為隨訪總生存期及無病進展期的截點。結果表明：隨訪期內，116例患者中有68例進展，61例死亡。3年總累計無病生存率及總生存率分別為41.4 % 和47.4%。為研究miR-155表達對預后的影響，依據miR-155在胃癌患者中表達的中位數分為高表達組及低表達組。采用K-M曲線分析miR-155表達在胃癌患者預后中的意義。3年累計無病生存率在高表達組為17.9 %，明顯低于低表達組的42.5 %(P<0.001，圖2A)；3年累計總生存率在高表達組為22.0%，明顯低于低表達組的50.5 %(P<0.001，圖2B)。

表1 胃癌組織miR-155表達與患者臨床病理特征的關系

圖2 胃癌患者基于miR-155表達的Kaplan-Meier生存曲線A：3年無病進展生存率；B：3年總生存率

2.4 miR-155表達與抑癌基因PTEN表達的相關性 結果表明：miR-155表達與PTEN表達負相關(r=-0.8453,P<0.001)，miR-155高表達患者PTEN表達較低(圖3、圖4)。

圖3 胃癌組織miR-155不同表達組中PTEN蛋白的表達Original magnification: ×20 (A, B), ×40 (C, D)

圖4 胃癌組織PTEN的表達與miR-155表達的相關性

3 討 論

Tsukamoto等[6]采用基因芯片方法分析470種miRNA在胃癌中表達，篩選出胃癌miRNAs表達譜。Zhang等[7]研究結果顯示，miR-21在胃癌組織中表達上調，其通過作用于靶基因第10號染色體上缺失與張力蛋白同源的磷酸脂酶基因(PTEN)，從而促進胃癌增殖和轉移。這些研究結果表明，miRNAs發揮促癌基因或抑癌基因作用，參與胃癌發生發展。

MiR-155是一種經典的多功能miRNA，參與許多生物過程，包括造血、免疫及炎癥反應。miR-155可以抑制Caspase-3或促凋亡基因TP53BP1的活性，起到抗凋亡的作用[8]，還可以通過下調SOCS1基因起到促進增殖的作用[9]。Yamanaka等[10]發現，miR-155在淋巴瘤/白血病中高表達，通過下調抑癌基因，如PTEN、PDCD4 和SHIP1，激活Akt信號通路促進疾病進展。Du等[11]發現，miR-155在鼻咽癌中高表達，且能夠下調與疾病進展及臨床預后相關的基因JMJD1A的表達。以上證據顯示，miR-155在惡性腫瘤的發生、進展及預后方面起著不可忽視的作用。

為了探討miR-155在胃癌中的作用，本研究采用RT-qPCR技術檢測116例胃癌及配對癌旁組織miR-155的表達水平，并分析其與胃癌臨床病理特征的關系。本研究結果顯示，miR-155在胃癌組織中表達升高，且高表達miR-155與TNM分期、腫瘤侵犯層次及淋巴結轉移有關。研究結果發現，miR-155的表達與PTEN負相關，miR-155高表達患者PTEN表達較低，提示miR-155在胃癌中可能通過靶向PTEN蛋白發揮致癌作用，且參與胃癌進展。

為了進一步研究miR-155的表達在胃癌患者預后中的作用，本研究隨訪了術后116例胃癌患者。36個月的隨訪期內，116例患者中有68例進展，61例死亡。K-M曲線分析結果提示：3年累計無病生存率在miR-155高表達組為17.9%，而在低表達組為42.5%。3年累計總生存率在高表達組為22.0%，低表達組為50.5%。Log-rank檢驗提示：miR-155高表達組的3年累計無病生存率及3年累計總生存率均低于miR-155低表達組(P<0.001)。結果提示高miR-155表達可能預示著胃癌患者較差的預后。

Lu等[12]報道，miR-155在胃癌組織中高表達，并且參與胃癌的進展，與本研究結果一致。本研究納入了含有116例患者的隊列研究，并且對患者的預后進行了分析，發現miR-155在胃癌組織中也呈高表達趨勢，并且還與TNM分期、腫瘤侵犯層次及患者的預后密切相關。

綜上所述，miR-155可能是胃癌潛在的診斷、預后及治療靶點，測定血漿中miR-155的表達可能會成為早期診斷胃癌及評價預后的輔助指標。

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[本文編輯] 葉 婷， 賈澤軍

Expression of miR-155 in gastric cancer and its prognostic significance

ZHOU Ming, MA Jian-ming*

Department of General Surgery, Yangzhou No.1 People’ Hospital, Yangzhou 225001, Jiangsu, China

Objective：To discuss the expression of miR-155 and its clinical significance in gastric carcinoma.Methods：One hundred and sixteen pairs of human gastric carcinoma tissues were obtained from patients who underwent surgical resection.The level of miR-155 in 116 gastric cancer tissues and the adjacent normal gastric tissues were detected by real-time fluorescent quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-qPCR), and the association between miR-155 expressions with clinicopathological factors and prognostic values were explored.Immunohistochemical staining for PTEN in all pathological specimens from gastric cancer biopsy was performed.The correlationship between PTEN and miR-155 expression was analyzed.Results：The expression of miR-155 in gastric cancer tissues was higher than that of adjacent normal gastric tissues (P<0.001).The up-regulated expression of miR-155 was associated with TNM stage, invasion level and lymph node metastases (P<0.05).Kaplan-Meier analysis demonstrated that high miR-155 expression clearly predicted poorer progression free survival (PFS,P<0.001) and overall survival (OS) (P<0.001) within three years.PTEN expression was negatively correlated to miR-155 expression.Gastric cancer tissues with higher miR-155 expression disclosed lower PTEN expression (P<0.001).Conclusions：MiR-155 may plays a pivotal role in the development and progression of gastric carcinoma, and it may be the potential biomarker in the diagnosis and prognosis of gastric carcinoma.

gastric carcinoma; miR-155; PTEN; clinical significance; prognosis

2016-01-21[接受日期]2016-09-26

周 明，碩士生，主治醫師.E-mail: 13852200328@163.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 0514-82981199-81006, E-mail: genesis.7@live.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160076

R 735.2

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