三氧化二砷對VEGF誘導人骨肉瘤SaOS-2細胞TRAF-2和STAT-6表達的影響

吳永輝林 曉羅冬嬌鐘永翔王恩智王鑫華

三氧化二砷對VEGF誘導人骨肉瘤SaOS-2細胞TRAF-2和STAT-6表達的影響

吳永輝1林 曉1羅冬嬌2鐘永翔1王恩智1王鑫華1

目的通過觀察三氧化二砷（As2O3）對血管內皮生長因子（VEGF）誘導人骨肉瘤SaOS-2細胞腫瘤壞死因子受體相關因子（TRAF-2）和信號轉導子與轉錄激活子（STAT-6）表達的影響，探討As2O3治療骨肉瘤的作用機制。方法分別采用CCK8法、實時熒光定量PCR法和流式細胞術測定細胞生長抑制率、TRAF2和STAT-6的表達。結果2μmol/L的As2O3對SaOS-2細胞的生長抑制率達57%（0.57±0.03比0）（P＜0.01），使VEGF誘導作用顯著降低（0.42±0.02）（P＜0.05），TRAF-2及STAT-6的表達也顯著下降（分別為：149.00±7.21比167.33±8.02；1.29±0.12比2.53±0.67）（P均＜0.05）。結論As2O3可能通過TRAF-2和STAT-6途徑對SaOS-2細胞的生長呈劑量相關的抑制作用。

骨肉瘤；SaOS-2細胞；As2O3；TRAF-2；STAT-6;VEGF

骨肉瘤是一種起源于間葉組織最常見的骨骼系統惡性腫瘤，多數病例在原發灶較小的早期即發生廣泛的轉移，病情兇險，進展迅速，其發病機制至今尚未完全清楚。研究表明，骨肉瘤的發生、發展、預后與炎癥因子及凋亡的異常表達密切相關。最近研究發現，腫瘤壞死因子受體（TNF-R）相關因子（TRAF）和信號轉導子與轉錄激活子（STAT）參與了癌癥的發病過程[1]，但它們在骨肉瘤發病機制中所起的作用如何國內報道甚少。三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）被認為是一種低毒、有效的化療藥物，已在Ⅲ期成骨肉瘤、尤文肉瘤患者取得較好的近期臨床療效[2]，但其具體機制不清。本研究通過觀察血管內皮生長因子（vascular endotheilial growth factor，VEGF）誘導SaOS-2人骨肉瘤細胞TRAF-2和STAT-6表達及As2O3對其表達的影響，探討As2O3治療骨肉瘤的機制，為臨床治療提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 SaOS-2細胞株購于上海細胞所，VEGF購于PROSPEC公司，一抗TRAF2抗體購于abcam公司（批號ab12122），注射用As2O3由北京雙鷺藥業股份有限公司產生（批號20130304）。

1.2 細胞培養及分組 復蘇SaOS-2人骨肉瘤細胞，細胞在1640培養基（含青霉素、鏈霉素和10%胎牛血清）（購于gibco公司），置于37℃、5%CO2培養箱（型號3111，Thermo公司生產）中培養，使用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，0.25%胰蛋白酶消化細胞，進行傳代培養并調整細胞狀態。接種于6孔細胞培養板，分別給予VEGF（10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL）（命名為 V10組、V50組、V100組）、As2O3（1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L）（分別命名為 A1組、A2組、A4組）、VEGF 100ng/mL聯合As2O3 2μmol/L（命名為A2+100組）及細胞對照組（不加VEGF或As2O3）。

1.3 CCK-8 檢測：取生長對數期細胞，細胞濃度為3.5×103/孔，加藥后繼續置于5%CO2培養箱培養48h。使用CCK-8檢測各組細胞的吸光度（OD）值，具體操作方法按說明書進行。每組分別做3次平行實驗，每孔細胞重復3次檢測取其平均值，并設空白組調整。細胞生長抑制率=（對照組的OD值-樣品組的OD值）/對照組的OD值×100%，細胞活力=樣品組的OD值/對照組的OD值×100%。

1.4 總RNA提取和實時熒光定量PCR法（RT-qPCR）測定STAT-6表達 調整細胞密度為每孔2× 105個，細胞加藥培養48h后，將細胞消化收集，加入Trizol 1mL裂解細胞提取總RNA（購自Generay公司，批號1305G09），取2μL RNA溶液于Merinton SMA4000檢測，觀察A260/A280、A260/A230比值及連續波長吸收峰，并計算RNA溶液濃度，判斷RNA提取質量：A260/A280＞2.0且＜2.3，則可以滿足后續RT-qPCR所需。并逆轉錄成cDNA（逆轉錄試劑盒購自Fermentas公司，批號00141145），實時熒光定量PCR的方法檢測STAT-6的表達（qPCR試劑Super-Real Premix Plux購自TIANGEN公司，批號#M2029）。引物序列（由上海捷瑞公司合成）如下：STAT-6的上游引物5’-GGCAACCAAGACAACAATG-3’，下游引物5’-：TGCTGATGAAGCCAATGAT-3’，PCR產物大小為385bp；內參GAPDH的上游引物5’-AGAAG GCTGGGGCTCATTTG-3’，下游引物5’-AGGGGCCA TCCACAGTCTTC-3’，PCR產物大小258bp。實驗步驟參照說明書進行。反應條件如下：50℃ 3min、95℃15min、95℃ 10s、59℃ 20s、72℃ 30s（40循環）、95℃10s（融解曲線），退火溫度為60度。每個樣本重復3次試驗，通過觀察樣本擴增曲線和熔解曲線了解實驗情況，同時進行內參基因GAPDH檢測（定量PCR儀為CFX connect Real-Time PCR System），結果分析采用比較 CT值法：△CT實驗組/對照組= CTSTAT-6-CTGAPDH，△△CT=△CT實驗組-△CT對照組，基因相對表達量（RQ）采用2-△△CT方法計算。

1.5 流式細胞術法測定TRAF-2表達 收集加藥后細胞，PBS洗滌細胞兩遍，1500rpm離心10min（臺式低速離心機：80-2型，上海醫療器械有限公司生產），4%多聚甲醛室溫固定30min，PBS洗滌細胞兩遍，同上離心后，0.1%曲拉通室溫破膜30min，再次如上離心，10%BSA室溫封閉30min，離心棄封閉液，以100μl 10%BSA重懸細胞，加入0.2μg TRAF2抗體（0.1μg/105個細胞），室溫孵育30min，PBS洗滌細胞二遍，離心后沉淀物以100μL 10%BSA重懸細胞，加入0.2μg FITC-熒光二抗（0.1μg/105個細胞），室溫避光孵育30min，PBS洗滌細胞二遍，1500rpm離心10min，500μL PBS重懸細胞，上機檢測（Accuri C6流式細胞儀由BD公司生產），門內收集5000個細胞，記錄平均熒光強度（meanfluorescence intensity，MFI）。另設空白對照組（不加抗體，其他處理同上）。

1.6 統計學方法 應用SPSS16.0統計軟件分析，數據以均數±標準差（±s）表示。組間樣本均數比較采用單因素方差分析，Levene法檢驗方差齊性。多組間兩兩比較方差齊時應用LSD-t檢驗，方差不齊時應用Dunnett T3檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 骨肉瘤細胞活力及細胞生長抑制率 CCK-8細胞活力分析顯示，V100組細胞生長活力顯著高于對照組（P＜0.05），V50組、V10組的細胞生長活力與對照組差異無統計學意義（P＞0.05）。A2組、A4組細胞生長抑制率顯著高于對照組（P均＜0.01），A1組與對照組差異無統計學意義（P＞0.05）。A2+100組細胞生長抑制率顯著低于A2組（P＜0.05），見表1-2。

表1 VEGF誘導SaOS-2人骨肉瘤細胞生長活力（±s）

表1 VEGF誘導SaOS-2人骨肉瘤細胞生長活力（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別對照組V10組V50組V100組濃度（mg/mL）0 10 50 100株數3 3 3 3細胞活力1 1.12±0.07 1.14±0.05 1.50±0.10*

表2 As2O3對SaOS-2人骨肉瘤細胞生長抑制率（±s）

表2 As2O3對SaOS-2人骨肉瘤細胞生長抑制率（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與A2組比較，△P＜0.05

?

2.2 STAT-6 mRNA表達 RT-qPCR檢測結果顯示，目的基因的熔解曲線均為單一峰，熔解溫度為87.5℃。V100組STAT-6 mRNA表達水平顯著高于對照組（P＜0.05），A2+100組顯著低于V100組（P＜0.05），見表3。

表3 各組STAT-6 mRNA和TRAF-2蛋白表達水平比較（±s）

表3 各組STAT-6 mRNA和TRAF-2蛋白表達水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與V100組比較，▲P＜0.05

組別對照組V100組A2+100組株數3 3 3 STAT-6 RQ值（2-△△CT）1 2.53±0.67* 1.29±0.12▲TRAF-2（MFI值）136.33±6.11 167.33±8.02** 149.00±7.21▲

2.3 TRAF-2蛋白表達 流式細胞術結果顯示，V100組TRAF-2蛋白的表達水平顯著高于對照組（P＜0.01），A2+100組顯著低于V100組（P＜0.05），見表3、圖1。

圖1 流式細胞術檢測TRAF-2蛋白表達水平

3 討 論

TRAF家族是一種細胞內沒有死亡域結構的TNF-R超家族成員之一，最初作為直接結合胞質區TNF-R超家族的信號接頭，也具有E3泛素連接酶的活性并激活下游區的信號靶點。依賴TRAFs激活的具有代表性的信號通路為NF-κBs、胞外信號調節激酶激酶（MAPKs）和干擾素調節因子（IRFs）[3]。它具有重要的生理作用，能調節天然和獲得性免疫、胚胎發育、組織動態平衡、應激反應、骨新陳代謝、炎癥及腫瘤等疾病[4-5]。抑制TRAF-2介導的NF-κB的活性可促進核轉錄因子激活蛋白質1（AP-1）的產生，通過調節TRAF-2的途徑可作為抗癌和抗炎的治療藥物[6]。研究[7]發現，TRAF-2和谷胱甘肽轉移酶以復合物的形式激活允NK及P38信號通路，參與人骨肉瘤細胞的凋亡和細胞周期阻止。本研究發現，加入VEGF后人骨肉瘤細胞TRAF-2的表達增加，提示VEGF能誘導人骨肉瘤細胞增加分泌TRAF-2，推測VEGF可能通過TRAF-2的途徑促進骨肉瘤的進展。

STAT家族是一種存在于胞漿并在激活后能夠轉入核內與DNA結合的蛋白家族，具有信號轉導和轉錄調控雙重功能。廣泛表達于機體不同類型的細胞和組織中，參與細胞生長、分化、凋亡等多種生理功能的調控，并與炎癥、腫瘤和免疫反應關系密切。其機制可能通過允AK/STAT信號通路參與骨肉瘤細胞的增殖、移行和侵襲[8]。研究[9]發現骨肉瘤STAT-3陽性表達率明顯高于骨軟骨瘤，且與是肺轉移及Enneking分期有關，認為STAT-3與骨肉瘤的惡性程度及轉移有關；可能是STAT-3的過度激活抑制了腫瘤細胞凋亡，從而促進骨肉瘤的發生發展。本研究發現，加入VEGF后人骨肉瘤細胞STAT-6的表達增加，提示VEGF能誘導人骨肉瘤細胞增加分泌STAT-6，推測VEGF可能通過STAT-6的途徑促進骨肉瘤的進展。

本研究進行CCK8檢測發現，V100組顯著高于V50組及對照組，V50組與對照組差異無統計學意義（P＞0.05），提示100ng/mL的VEGF對細胞增殖有促進作用；A2組、A4組顯著低于對照組，A1組與對照組差異無統計學意義（P＞0.05），提示低濃度（1μmol/ L）As2O3對細胞無明顯作用，中濃度（2μmol/L）和高濃度（4μmol/L）有明顯抑制作用。故本研究采用100ng/mL VEGF聯合2μmol/L As2O3，觀察As2O3的治療作用。

以往研究發現，1μmol/L以上濃度的As2O3可明顯地抑制MG-63骨肉瘤細胞增殖，抑制率可達70%，細胞呈典型的凋亡改變，c-myc mRNA被明顯抑制，細胞周期阻滯于G2/M期[10]。在胃癌細胞系也取得相似的結果[11]。本研究發現，CCK8細胞活力分析顯示，A2組、A4組骨肉瘤細胞的抑制率高于對照組，而A1組與對照組無差異。提示1μmol/L的As2O3對骨肉瘤細胞增殖抑制作用不明顯，但隨著作用濃度增加，細胞生長抑制效應逐漸增強，具有一定的量-效關系。A2+100組的細胞抑制率、TRAF-2 和STAT-6低于A2組，提示2μmol/L的As2O3能抑制VEGF對骨肉瘤細胞的誘導作用，推測As2O3對骨肉瘤具有一定的治療作用。

綜上所述，As2O3能抑制 VEGF對骨肉瘤SaOS-2細胞的誘導作用，2μmol/L的As2O3濃度能抑制骨肉瘤SaOS-2細胞的活力、TRAF-2和STAT-6的表達。

［1］陳曉東，周新社，李昭程，等.STAT3在骨肉瘤中的表達及其與腫瘤微血管密度的關系［J］.蚌埠醫學院學報，2013，38（10）：1260-1263.

［2］郭衛，湯小東，唐順，等.三氧化二砷聯合化療治療Ⅲ期成骨肉瘤、尤文肉瘤的初步報告［J］.中華外科雜志，2006，44 （12）：805-808.

［3］So T，Soroosh P，Eun SY，et al.Antigen-independent signalosome of CARMA1，PKCθ，and TNF receptor-associated factor 2（TRAF2）determines NF-κB signaling in T cells［允］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（7）：2903-2908.

［4］Chen Z，Sheng L，Shen H，et al.Hepatic TRAF2 regulates glucose metabolism through enhancing glucagon responses［允］.Diabetes，2012，61（3）：566-573.

［5］Piao JH，Hasegawa M，Heissig B，et al.Tumor necrosis factor receptor-associated factor（TRAF）2 controls homeostasis of the colon to prevent spontaneous development of murine inflammatory bowel disease［J］.允Biol Chem，2011，286（20）：17879-1788.

［6］Manna SK，Babajan B，Raghavendra PB，et al.Inhibiting TRAF2-mediated activation of NF-kappaB facilitates induction of AP-1［J］.允Biol Chem，2010，285（15）：11617-11627.

［7］Sau A，Filomeni G，Pezzola S，et al.Targeting GSTP1-1 induces允NK activation and leads to apoptosis in cisplatinsensitive and-resistant human osteosarcoma cell lines［J］. Mol Biosyst，2012，8（4）：994-1006.

［8］Sandoval-Usme MC，Umana-Pérez A，Guerra B，et al.Simvastatin impairs growth hormone-activated signal transducer and activator of transcription（STAT）signaling pathway in UMR-106 osteosarcoma cells［J］.PLoS One，2014，9（1）：e87769.

［9］張濤，徐志濤，崔陽，等.GRIM-19和STAT3在骨肉瘤中的表達及意義［J］.承德醫學院學報，2013，30（5）：369-372.

［10］方成，陳振光，喻愛喜，等.三氧化二砷誘導骨肉瘤細胞凋亡的實驗研究［J］.中華骨科雜志，2003，23（6）：345-348.

［11］Ma ZB，Xu HY，Jiang M，et al.Arsenic trioxide induces apoptosis of human gastrointestinal cancer cells［J］.World 允Gastroenterol，2014，20（18）：5505-5510.

（收稿：2015-08-13 修回：2015-10-07）

Effects of Arsenic Trioxide on the Expression of TRAF-2 and STAT-6 on Human Osteosarcoma SaOS-2Cell Line Induced by VEGF

WU Yonghui1,LIN Xiao1,LUO Dongjiao2,ZHONG Yongxiang1,WANG Enzhi1, WANG Xinhua1. 1 Department of Osteology(WU Yonghui,LIN Xiao,ZHONG Yongxiang),Department of Clinical Laboratory(WANG Enzhi,WANG Xinhua),Intergated Chinese and western Medicine Hospital of Taizhou,Taizhou (317523),China;2 Department of Laboratory Medicine,Medicine College of Hangzhou Normal University,Hangzhou (311121),China

ObjectiveTo investigate the effect of arsenic trioxide（As2O3）on the expression of tumor necrosis factor receptor-associated factor 2（TRAF-2）and signal transducer andactivator of transcription 6（STAT-6）on human osteosarcoma SaOS-2 cell line induced by vascular endothelial growth factor（VEGF）,in an attempt to explore the mechanism of As2O3 treating human osteosarcoma.MethodsCCK8 assay,real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（QRT-PCR）and flow cytometry methods were used to determine the inhibition rate and expression levels of TRAF-2 and STAT-6 on osteosarcoma SaOS-2 cell line after treatment with As2O3.ResultsTreated with As2O3 of 2 μmol/L,the inhibition ratio of SaOS-2 cell line reached 57%（0.57±0.03 vs 0, P＜0.01）and the induction function of VEGF was notably depressed（0.42±0.02,P＜0.05）.The expression levels of TRAF-2（149.00±7.21 vs 167.33±8.02）and STAT-6（1.29±0.12 vs 2.53±0.67）significantly decreased（all P＜0.05）.ConclusionThe inhibition function of As2O3 on osteosarcoma cell proliferation is in a dose-dependent manner, which may be related to TRAF-2 and STAT-6 pathway.

osteosarcoma;SaOS-2 cell line;arsenic trioxide;tumor necrosis factor receptor-associated factor 2; signal transducer andactivator of transcription 6;vascular endothelial growth factor

浙江省自然基金資助項目（No.LY13H080006）；浙江省溫嶺市科技局基金資助項目（No.2013-1-64）

1浙江省臺州市中西醫結合醫院骨科（吳永輝、林曉、鐘永翔）、檢驗科（王恩智、王鑫華）（臺州 317523）；2杭州師范大學醫學院檢驗系（杭州 311121）

林曉，E-mail：linxiaozg@163.com