辛伐他汀對血管緊張素II誘導心肌細胞損傷模型大鼠心肌細胞ACE2的影響

倪市毛姜昌浩陳智理駱高江黃檢英楊 劍

辛伐他汀對血管緊張素II誘導心肌細胞損傷模型大鼠心肌細胞ACE2的影響

倪市毛1姜昌浩1陳智理1駱高江1黃檢英2楊 劍3

目的觀察辛伐他汀（SIM）對血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導心肌損傷模型大鼠心肌細胞ACE2的影響。方法制備AngⅡ誘導心肌細胞損傷大鼠模型，隨機分為空白對照組、AngⅡ組、小劑量他汀組+AngⅡ組、中劑量他汀組+AngⅡ組、高劑量他汀組+AngⅡ組。應用Western blot、PCR技術檢測各組大鼠心肌細胞ACE2蛋白和基因表達。結果與空白對照組比較，心肌損傷模型組（AngII組）ACE2蛋白和基因表達下降（0.21比0.74，0.333±0.122比1.000±0.149），兩組差異有統計學意義（P＜0.05）；與AngⅡ組比較，小劑量他汀組ACE2蛋白（0.39）和基因表達（0.399±0.054）略升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）；中劑量他汀組ACE2蛋白（0.45）和基因表達（0.644±0.135）、高劑量他汀組ACE2蛋白（0.61）和基因表達（0.952±0.090）與AngⅡ組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），且ACE2蛋白和基因表達隨著辛伐他汀濃度的升高而上升。結論AngⅡ刺激心肌細胞致ACE2蛋白、ACE2基因表達下降，而辛伐他汀可抑制該作用，使受AngⅡ損傷的心肌細胞ACE2蛋白、ACE2基因表達升高，其作用隨藥物濃度升高而增加。

大鼠；心肌細胞損傷；辛伐他汀；血管緊張素II；血管緊張素轉化酶

心衰患者腎素血管緊張素醛固酮系統（RAAS）過度激活，體內血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）表達大量增加導致心肌細胞損傷[1]。研究表明，他汀類藥物能通過其抗氧化機制減少因AngⅡ升高而引起的心肌細胞凋亡和壞死。目前他汀類藥物除了被廣泛用于降脂穩定斑塊外，還被應用于心功能衰竭患者以達到改善心肌重構的治療目的。2000年Donoghue[2]和Tipnis[3]發現ACE2（血管緊張素轉化酶的同系物），研究證實ACE2可降解AngⅡ生成Ang-（1-7）作用Mas受體，具有拮抗細胞增殖、抗炎、減少心肌細胞損傷的作用，它的過表達對衰竭的心臟具有保護作用，可改善心衰患者的臨床預后。多年來他汀類藥物能減輕AngⅡ對心肌細胞的損傷已得到廣泛認可，其機制多被解釋為抗炎、抗氧化。然而在AngⅡ損傷心肌細胞過程中他汀類藥物對ACE2是否有影響，目前確鮮有報道。本研究通過在AngII損傷大鼠心肌細胞中加入不同濃度的辛伐他汀，觀察其對ACE2基因及蛋白表達的影響。

1 實驗材料

1.1 細胞來源 出生1～3天新生SD大鼠乳鼠40只，上海斯萊克試驗動物有限責任公司提供，生產許可證號為SCXK（滬）2012-002，SPF級。

1.2 試 劑 試劑FBS（hyclone公司），DME培養基（GIBCO），胰酶（GIBCO）青霉素-鏈霉素（GIBCO），AngII（北京達科），辛伐他丁（SIM）（Sigma，363529）。0.45μmPVDF膜（Millipore公司），0.2μmPVDF膜（Bio-Rad公司），SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、ECLPlus試劑盒、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天公司）、Western及 IP細胞裂解液，GAPDH （BIOWORLD，AP0063），ACE2（santa，sc-20998）。逆轉錄試劑盒 RevertAidFirstStrandcDNAsynthesisKit （Fermentas公司；貨號#K1622；批號00141145）；qPCR試劑 SuperRealPreMixPlus（withSYBRGreenI）（TIANGEN公司）（貨號cat#FP205-02；批號#M2029）。

1.3 儀 器 細胞培養箱3111型（Thermo公司），微量加樣器（Thermo公司），臺式高速冷凍離心機H1650R（上海盧湘儀），熒光顯微鏡BX-43型（Olympus公司），超凈工作臺（蘇州凈化），渦旋振蕩儀QL-861型（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），凝膠成像儀（Bio-RAD公司），酶標儀SPECTRAmaxPlus384 （MolecularDevices公司），臺式高速冷凍離心機H1650R（上海盧湘儀），電泳系統（Bio-RAD公司），OD值測量儀器為MerintonSMA4000；定量PCR儀為CFXconnectReal-TimePCRSystem，配套分析軟件為BIO-RADCFXManager。

2 實驗方法

2.1 心肌細胞原代培養 取40只乳鼠心臟，置于預冷的PBS中漂洗1遍；取心室，置于預冷的PBS中漂洗1遍；將心室剪碎至糊狀，預冷的PBS中漂洗1遍，置15mL離心管，1500rpm，5min。收集組織沉淀，加入0.1%胰酶10mL重懸，37℃水浴鍋中震蕩消化5min。劇烈震蕩30s，待組織自然沉降，小心吸棄消化液上清。向組織沉淀中加入新的0.1%胰酶5mL重懸，37℃水浴鍋中震蕩消化5～10min。劇烈震蕩30s，待組織自然沉降，小心吸取消化液上清（含消化下來的細胞）置于新的15mL離心管中，并加入5mL DMEM完全培養基終止消化。向管中剩余組織中加入新的0.1%胰酶5mL重懸，重復上述步驟8～10遍，至無明顯組織塊殘留。收集細胞懸液，200目過篩，收集懸液，1500rpm，5min，收集細胞沉淀，以DMEM完全培養重懸，接種于10cm培養皿中，37℃，5%CO2，飽和濕度培養2h，收集未貼壁細胞（差速貼壁，2h內心肌成纖維細胞先貼壁，心肌細胞未貼壁）為心肌細胞，1500rpm，5min，收集心肌細胞沉淀，以DMEM完全培養重懸，接種于6孔板中，37℃，5%CO2，飽和濕度培養。

2.2 分 組 將培養48h后的心肌細胞進行分組，空白對照組（不加任何藥物），AngII組（加入10～7mol/L的AngⅡ），各辛伐他汀治療組（10-7mol/L AngⅡ刺激48h后再分別加入小劑量（10-7mol/L）、中劑量（10-6mol/L）、大劑量（10-5mol/L）的辛伐他汀，各組加藥完畢后37℃，5%CO2，飽和濕度培養48h后分別對各組進行ACE2基因和ACE2蛋白檢測。

2.3 ACE2基因的QPR檢測 Trizol-離心柱法提取細胞總RNA搜集細胞樣本后，用1mL大小的針筒抽吸Trizol裂解液15～20次，剪切基因組DNA。按200μL氯仿/mL Trizol的比例加入氯仿，震蕩30s混勻，在12 000rpm條件下離心5min。將試管上層液吸至另一離心管中，加入無水乙醇約150μL，稍震蕩混勻，將上述溶液轉移至放置于2mL收集管內的Gen-Clean柱中，放置室溫下2min，12 000rpm離心1min。去除廢液，加入450mL RPESolution后，室溫條件下12 000rpm離心30min。上述溶液離心后全部再次轉移到套放于2mL收集管內的GenClean柱中，放置室溫下2min，12 000rpm再離心1min。去除廢液，將GenClean柱放回收集管，室溫10 000rpm，離心30min。將GenClean柱轉移至1.5mL離心管中，Gen-Clean柱中央加入40μL EPC-H2O，放置于55～80℃條件下2min，室溫12000rpm離心1min。

2.4 逆轉錄實驗 取2mLRNA溶液于MerintonS-MA4000檢測，觀察A260/A280、A260/A230比值及連續波長吸收峰，并計算RNA溶液濃度，判斷RNA提取質量：A260/A280＞2.0且＜2.3，則可以滿足后續RT-qPCR所需，以相應溶劑為對照（Blank）。把隨機引物1μL、總RNA11μL加入到EP管中（總共12μL），震蕩混勻，短暫離心，65℃溫度干浴5min。在冰上冷卻，短暫離心，再放回冰上。將5xReactionBuffer 4μL、RibolockTMRNaseInhibition（20U/μL）1μL、10mMdNTP （mix）2μL、RevertAidTMM-MmLvReverseTranscriptase 1μL加入EP管中至總體積20μL，混勻后25℃干浴5min，再42℃溫度下干浴1h，70℃溫度干浴5min終止反應。

-20℃保存cDNA。進行熒光定量PCR擴增。引物序列如下：Ratβ-ActinForward:5‘CCCATCTATGAGGGTTACGC3’，Ratβ-ActinReverse:5‘TTTAATGTCACGCACGATTTC3’，目標基因的GenbankIDGeneID:81822;PCR產物大小為150bp。RatACEForward:5‘ACCTTACGAGCCTCCTGTCAC3’RatACEReverse:5‘CTGCGTTACTTTCTCCTTTGC3’目標基因GenbankID為 GeneID:320668；PCR產物大小為：182bp。

2.5 Western blot檢測ACE2蛋白 收集各組細胞，每管中加入100μL Western及IP裂解液（使用前加入PMSF，終濃度1mM），使用手術剪剪碎組織塊，組織勻漿機處理，4℃、12 000rpm，10min，取上清液-80℃儲存，BCA法測定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳制膠，上樣前樣品加入5×上樣緩沖液混勻，100℃環境中停留10min后冰浴中冷卻，各泳道上樣量約為80μg。將電泳緩沖液加入到電泳槽內后，接通電源，90V條件下恒壓電泳至溴酚藍跑完濃縮膠層，分離膠120V恒壓電泳，當溴酚藍遷移至分離膠下緣時，關掉電源，停止電泳。將PVDF膜先放置甲醇中浸泡30s，然后放入轉移緩沖液浸泡10min，再與濾紙、凝膠同時浸入電轉移緩沖液中。按照夾心法將海綿、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、海綿按序放好，除去氣泡，PVDF膜放置在陽極側，凝膠放置在陰極側，插進電泳槽，將緩沖液倒入電泳槽，200mA條件下恒流轉移，據蛋白分子量，約1min/kd。再將PVDF膜放置于封閉液中，在搖床上搖動，在室溫條件封閉過夜。取出PVDF膜，加入一抗后室溫條件下孵育2h，浸入1×TBST緩沖液中，放置搖床上反復洗滌3次后加入二抗（每次洗滌15min），在室溫搖床上再次孵育1h，將PVDF膜浸于1×TBST緩沖液中，于搖床上再洗滌3次（每次15min），將PVDF放置保鮮膜上，取適量ECL試劑盒中等體積的A液和B液混合，混勻后加在膜的表面，移入凝膠成像分析儀中，化學光敏模式曝光顯影。照片以TIFF格式導出后在Image允軟件下分析各條帶光密度。

2.5 統計學方法 應用SPSS13.0軟件分析統計，所收集的數據以均數±標準差（±s）表示，用單因素方差分析進行組間比較，組間兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 熒光定量PCR檢測ACE2基因表達 與空白對照組比較，AngⅡ組ACE2基因表達明顯減少（P＜0.05）；小劑量辛伐他汀治療組ACE2基因表達較AngⅡ組稍高但差異無統計學意義（P＞0.05），中、高劑量辛伐他汀治療組ACE2基因表達較AngII組和小劑量辛伐他汀治療組明顯增加（P＜0.05）。見表1。

表1 各組ACE2基因PCR檢測結果比較（±s）

表1 各組ACE2基因PCR檢測結果比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與AngⅡ組和AngⅡ+小劑量他汀組比較，△P＜0.05

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3.2 Western bolt檢測ACE-2蛋白表達 與空白對照組比較，AngⅡ組ACE2蛋白表達明顯減少（P＜0.05）；小劑量他汀治療組ACE2蛋白表達較AngⅡ組稍高但差異無統計學意義（P＞0.05），中、高劑量他汀治療組ACE2蛋白表達均高于AngⅡ組（P＜0.05）。見圖1。

4 討論

血管緊張素轉換酶2（ACE2）是2000年由Donoghue、Tipnis新發現的腎素-血管緊張素系統（RAS）新成員，是已知的第一個ACE同系物，ACE2 mRNA在人類的心臟、腎臟等72種組織中廣泛分布，它位于染色體Xp22（5）上，由18個外顯子組成。其編碼的蛋白含有805個氨基酸。對于其生物學作用目前已有較多研究，研究人員發現ACE2與ACE作用相反，對心血管系統有保護作用，在一些RAS激活過度的疾病中（如高血壓、心力衰竭、冠心病）ACE2高表達對疾病的發生發展有明顯的抑制作用[4]。

ACE2的生理學功能主要體現在兩點[5]：（1）將Ang I轉化為Ang（1-9），后者再經過ACE的作用變成Ang（1-7）；（2）將AngⅡ直接水解為Ang（1-7），該作用是前者的400倍。Ang（1-7）是一種心血管保護性多肽，它作用于其特異性受體mas，在細胞內信號因子水平上拮抗AngⅡ，其具有利鈉利尿、抗細胞凋亡和增殖以及舒張血管的效應，其作用顯示了它是對抗血管緊張素Ⅱ的最強活性成分之一。在心力衰竭的病理過程中，RAS系統過度激活，AngⅡ水平也相應增高，最終導致心肌細胞凋亡壞死增加，隨之心功能下降。研究發現心力衰竭時心臟組織ACE2 mRNA明顯增加，增加的ACE2多肽水解AngⅡ致Ang（1～7）水平也相應增高，ACE2、Ang（1～7）兩者的增高可擴張血管、降低血壓、并能阻止心力衰竭發展。在ACE2基因敲除模型中，研究者觀察到左心室變薄、收縮力下降（EF值下降），提示ACE2對心功能的調節起到重要作用[6]。研究[7]推測其機制可能與如下有關：（1）ACE2抑制了AngⅡ誘導的氧自由基的產生；（2）抑制了蛋白激酶C、c-Src、ERK-p38及Ang Ⅱ-ROS-NF-kB信號通路及上調PI3K-Akt信號通路。

圖1ACE-2蛋白表達

慢性心力衰竭患者心臟射血減少，腎素血管緊張素醛固酮系統興奮，致AngⅡ分泌增加，心肌細胞損傷導致心衰加重。機制可能是AngⅡ作用于AT1受體激活磷脂酶C（PLC）、激活絲裂素活化蛋白激酶（Mitogen-ActivatedProteinKinase）[8-9]。他汀類藥物作為HMG-COA還原酶抑制劑，除了降低膽固醇，研究者對于其各種降脂外作用已經有了廣泛而深入的研究，包括降低氧化應激、改善內皮功能等作用[10]。Dechend等[11]以西立伐他汀喂養人腎素血管緊張素轉基因小鼠4～7周，結果提示西立伐他汀喂養組死亡率明顯降低，小鼠血壓顯著降低，同時明顯減少了膠原、纖維蛋白的產生。

本研究觀察到辛伐他汀能使血管緊張素Ⅱ損傷的心肌細胞ACE2表達升高，其作用隨濃度升高而提高。推測ACE2可能在辛伐他汀保護AngII損傷心肌中起到重要作用，進一步豐富了他汀類藥物的降脂外作用機制，為臨床正確應用提供了理論依據。但其確切機制依然不十分清楚，尚需進一步研究。

［1］Gavras I，Gavras H.Angiotensin II as a cardiovascular risk factor［J］.允Hum Hypertens，2002，16（2）：S2-6.

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（收稿：2015-04-12 修回：2015-10-18）

Effects of Simvastatin on ACE2 Cells in Rats with Angiotensin II Induced Myocardial Injury

NI Shimao1,允IANG Changhao1,CHEN Zhili1,LUO Gaojiang1,HUANG允ianying2,YANG允ian3.1 Department of Cardiology,Yiwu Central Hospital,Yiwu(322000),China;2 Department of Cardiology,the Second Hospital Affiliated to Wenzhou Medicine University,Wenzhou(325000),China;3 Department of Cardiology,the First Affiliated Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou(310000),China

ObjectiveTo investigate the effects of simvastatin on angiotensin converting enzyme 2（ACE2）cells in the process of angiotensin II（Ang II）induced myocardial injury in rats.MethodsMyocardial cells were cultured in vitro and pretreated with Ang II,then divided into AngII group,low-dose SIM+AngII group,mid-dose SIM+AngII group,and high-dose SIM+AngII group.Normal myocardial cells served as control group.Western Blot and PCR technique were used to detect expressions of ACE2 protein and gene in all groups.ResultsCompared with control group the ACE2 protein and gene expressions in AngII group decreased（0.21 vs 0.74,0.333±0.122 vs 1.000±0.149;P＜0.05）.Compared with AngII group,the expressions of ACE2 protein and gene in mid-dose SIM+ AngII group（0.45,0.644±0.135）and high-dose SIM+AngII group（0.61,0.952±0.090）significantly increased（all P＜0.05）,but those in low-dose SIM+AngII group slightly increased in the absence of significant difference（0.39, 0.399±0.054;P＞0.05）.The expressions of ACE2 protein and gene elevated with the increase of simvastatin concentration.ConclusionAngII decreases the expression of ACE2 protein and gene on myocardial cells.Simvastatin can inhibit this effect,by increasing the expression of ACE2 protein and gene on AngII-injued myocardial cells. This inhibition effect is in dose-dependent manner.

rats;myocardial cell injury;simvastatin;angiotensin II;angiotensin converting enzyme

浙江省義烏市科技計劃項目（NO.12-3-19）

1浙江省義烏市中心醫院心內科（義烏 322000）；2溫州醫科大學附屬第二醫院心內科（溫州 325000）；3浙江大學附屬第一醫院心內科（杭州 310000）

倪市毛，E-mail：nishimao@163.com