解脲支原體藥敏及對氟喹諾酮類藥物的耐藥性研究

潘軍平 蔣桂芳

解脲支原體藥敏及對氟喹諾酮類藥物的耐藥性研究

潘軍平 蔣桂芳

解脲支原體；氟喹諾酮類藥物；耐藥性；敏感性

非淋菌性尿道炎是臨床上常見的疾病，其發病率出現上升趨勢,并超過淋病[1]。根據相關研究[2]結果顯示，非淋菌性尿道炎主要是由于沙眼衣原體和解脲支原體（ureaplasma urealyticum，Uu）引起，患者發病后主要以尿頻、尿急、尿痛等為主，影響患者正常生活和工作[3]。目前，臨床上對于非淋菌性尿道炎尚缺乏理想的治療方法，常規抗生素雖然能夠改善患者癥狀，但是病菌耐藥性較高。氟喹諾酮類藥物屬人工合成廣譜抗生素，廣泛用于非淋菌性尿道炎患者，但是近年來解脲支原體對非淋菌性尿道炎耐藥株不斷增加，且報道研究發現多為基因突變引起的氨基酸改變引起[4]。為了探討解脲支原體藥敏及對氟喹諾酮類藥物的耐藥性和敏感性。本研究選取我院收治的432例患者資料進行分析，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年4月—2014年4月本院收治的432例患者中共分離出解脲支原體101株，其中男45例，女56例，年齡16～65歲，平均（47.4±1.3）歲?；颊呷朐簳r臨床表現女性主要以白帶增多，部分患者伴有異位、外陰瘙癢等為主；男性則主要以尿道刺癢、燒灼感、尿頻、尿急等為主。男性解脲支原體取自尿道內3～4cm處，女性從宮頸內1～1.5cm處取材，對采集標本進行分離和鑒定。患者對實驗方案、實驗措施等有知情權。

1.2 方 法 研究中所用的Uu檢測以及藥敏分析試劑Mycoplasma ICS Kit試劑盒均由珠海麗珠試劑有限公司提供；DNA抽提、PCR以及相關試劑均由珠海麗珠試劑有限公司提供；實驗中支原體檢測以及藥敏分析必須嚴格遵循試劑盒相關操作步驟進行[5]。藥敏主要包括四環素類藥物，如強力霉素、美滿霉素；大環內酯類：交沙霉素、克拉霉素、羅紅霉素等；喹諾酮類：如氧氟沙星、左旋氧氟沙星等。每種抗生素藥物均制備兩種濃度。強力美素與美滿霉素為4mg/L和8mg/L；交沙霉素為2mg/L、8mg/L；克拉霉素、羅紅霉素以及氧氟沙星等藥物濃度均為1mg/L 和4mg/L。當藥敏兩孔均為紅色時為耐藥，藥敏孔低稀釋度變色，高稀釋度變化不明顯或不變色為重度敏感。選取1.5mL氟喹諾酮類耐藥菌株進行10min離心，離心速度為15 000r/min，離心的半徑調整為4.9cm，去除上層清液，采用0.01mmol/L PBS進行洗滌，然后進行2min心，離心速度為13 000r/min，離心半徑為4.9cm，去除上層清液，向沉淀物內加入200mg/mL蛋白酶K進行消化2h，滅活5min，離心30s，離心半徑4.9cm，速度1000r/min，取10μL作為標準模板[6-7]。

1.3 PCR引物及反應條件 參照相關文獻設計的引物，gyrA上下游引物序列分別為：5′-TTGCTGCTT TCGAAAACGG-3′，5′-CTGATGGTAAAACACTTGG-3′；gyrB上下游引物為5′-CCTGGTAAATTAGCTGAC TG-3′，5′-TTCGAATATGACTGCCATC-3′，反應體系含有5μL 10×buffer，濃度為1.5mmol/lmg CL2，0.2mmol/ L dNTP，引物濃度為0.5μmol/L，加入2.5uTaqDNA聚合酶，2μL模板DNA，并采用超純水將其補充到50μL，根據實驗要求設置PCR循環反應條件。擴增完畢后取10μL擴增產物，加入2μL溴酚藍，并取上層清液進行染色，并進行電泳實驗，采用紫外透射反射檢測分析儀觀察結果。將獲得的PCR擴張目的片段經過回收純化后進行測序，并將耐藥株測序結果采用Blast軟件和Genbank中Uu3基因序列進行比較，確定基因變化情況[8-9]。

2 結 果

2.1 101株Uu對常用抗生素的藥物敏感情況 喹諾酮類藥物對Uu的耐藥性最高。氧氟沙星耐藥30株，耐藥率29.90%；羅紅霉素耐藥24株，耐藥率23.76%；阿奇霉素、美滿霉素以及克拉霉素耐藥均為166株，耐藥率15.84%，見表1。

表1 101株Uu對常用抗生素藥物敏感情況[株（%）]

2.2 gyrA、gyrB基因擴增及突變分析 本研究PCR擴增中分別得到大小為335bp和310bp的片段，對4株耐喹諾酮Uu進行突變分析。結果顯示，2株耐喹諾酮Uu的gyrA302位堿基C-T誤義突變使其編碼的101位丙氨酸變為纈氨酸；1株在gyrA13位發生突變，但是氨基酸未發生改變，另外1株為突變。

3 討 論

抗生素治療非淋菌性尿道炎效果理想，但是隨著抗生素的不斷使用，Uu對抗生素的耐藥率出現上升趨勢[10]。本研究顯示，喹諾酮類藥物對Uu的耐藥性最高。交沙霉素和強力霉素對Uu均具有良好的敏感性，但是藥物不良反應發生率較高，且藥物價格比較昂貴，臨床上使用時受到患者家庭經濟等因素的限制[11]。氧氟沙星、羅紅霉素等耐藥性也出現上升趨勢，可能和藥物長期大劑量使用有關。因此，臨床上對于支原體感染患者治療時應該加強細菌培養和藥敏試驗檢測，提高藥物使用合理性，從而降低耐藥株發生率[12]。

氟喹諾酮類藥藥物作用靶位為細菌擴撲異構酶，包括旋轉酶和拓撲異構酶。其中，旋轉酶主要是由gyrA和gyrB組成的A2B2四聚體結構，并且由gyrA和gyrB基因編碼。而拓補異構酶則主要是由C2E2四聚體結構。目前，臨床上普遍認為[13]，細菌對喹諾酮類藥物的耐藥機制主要表現為靶酶的突變。根據相關研究[14]結果顯示，大腸埃希菌旋轉酶的突變經過出現在gyrA5′末端第199到318位堿基保守區。而gyrB5′的兩個位點，分別為425和447位氨基酸和喹諾酮類藥物耐藥關系密切。本研究對4株耐喹諾酮Uu進行突變分析顯示，2株耐喹諾酮Uu的gyrA302位堿基C-T誤義突變使其編碼的101位丙氨酸變為纈氨酸；1株在gyrA13位發生突變，但是氨基酸未發生改變，另外1株為突變。解脲支原體對氟喹諾酮類藥物產生的耐藥性可能還與其他機制和基因有關，尚需要進一步研究和分析。

綜上所述，解脲支原體對氟喹諾酮類藥物產生的敏感性主要是由于gyrA基因突變引起所控氨基酸發生變化，臨床用藥應選擇針對性的抗生素治療，提高臨床療效。

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（收稿：2015-08-27 修回：2015-10-26）

浙江省湖州市吳興區人民醫院檢驗科（湖州 313008）

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