人參二苓湯及其水提醇沉提取物對H22荷瘤小鼠脾胸腺指數及外周血細胞的影響

程 權傅華洲

人參二苓湯及其水提醇沉提取物對H22荷瘤小鼠脾胸腺指數及外周血細胞的影響

程 權1傅華洲2

目的探討人參二苓湯及其水提醇沉提取物對H22荷瘤小鼠脾胸腺指數及外周血細胞的影響。方法將60只健康昆明小鼠分為正常組、荷瘤模型組、陽性對照組（CTX組）、水提組（RSEL）、總多糖組（PRSEL）、小分子組（SRSEL），每組10只。建立H22荷瘤小鼠模型，造模成功后分別灌服人參二苓湯水提物、總多糖、小分子，實驗結束后計算小鼠脾胸腺指數，抑瘤率及外周血細胞的檢測。結果人參二苓湯水提物（RSEL）組和總多糖（PRSEL）組抑瘤率分別為37.80% 和50.13%；CTX組為79.62%；CTX組及人參二苓湯水提組和總多糖組平均瘤重分別為（0.7611± 0.1502）g、（2.3231±0.5324）g和（1.8642±0.5740）g，與荷瘤模型組平均瘤重（3.7352±0.4851）g比較，差異有統計學意義（P＜0.01），小分子組瘤重與荷瘤組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與水提組比較，總多糖組瘤重差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，人參二苓湯總多糖（PRSEL）組能顯著增強荷瘤小鼠脾和胸腺指數（P＜0.05或P＜0.01），且較人參二苓湯水提物（RSEL）組和小分子（SRSEL）組更為顯著；人參二苓湯總多糖（PRSEL）組能改善荷瘤小鼠晚期白細胞的過度增高狀態（P＜0.01），優于人參二苓湯水提物組（P＜0.05）。結論人參二苓湯總多糖（PRSEL）可以明顯延緩荷瘤小鼠晚期類白血病樣反應的發生，維持血細胞在一個相對穩定的狀態，且抑制腫瘤生長作用較明顯，可能與其改善荷瘤小鼠免疫器官功能相關。

H22荷瘤小鼠；人參二苓湯；總多糖；外周血細胞

為研究人參二苓湯抗腫瘤作用有效部位及其作用機制，本實驗通過建立H22肝癌移植瘤模型，觀察人參二苓湯及其水提醇沉提取物對荷瘤小鼠的腫瘤生長、脾和胸腺指數以及外周血細胞的影響，報道如下。

1 實驗材料

1.1 動 物 SPF級昆明小鼠60只，雄性，體質量（20±2）g，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供，實驗動物許可證號[SYXK（浙）2012-001]。所有小鼠在相同條件下，標準飼料飼養于浙江中醫藥大學動物實驗中心。

1.2 細胞株 小鼠H22肝癌瘤株，由浙江中醫藥大學生命科學學院實驗室提供。

1.3 主要藥品及試劑 人參二苓湯藥材由杭州市第一人民醫院中藥房提供；環磷酰胺（CTX，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司產品，批號14081425）；無支原體胎牛血清（杭州四季青生物有限公司），細胞培養基1640（杭州吉諾生物有限公司）。

1.4 主要儀器 全自動血液分析儀（SYSMEX CORPORPORATION），旋轉蒸發儀（上海申勝科技有限公司），數控恒溫水浴鍋（上海申勝科技有限公司），SHZ-D（Ⅲ）循環式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司），DLSB-低溫冷卻液循環泵（鄭州長城科工貿有限公司），SK2510HP超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司），熒光倒置顯微鏡（日本NIKON公司），SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇州泰安空氣技術有限公司）。細胞培養管（THERMO），萬分之一精密電子天平（AR21300haus-Corppine Brook，NT，USA）。

2 實驗方法

2.1 腫瘤模型的制備 取接種腫瘤后7天且生長良好的H22肝癌腹水型荷瘤小鼠，將其頸椎脫臼處死，在無菌條件下抽取乳白色腹水，用生理鹽水稀釋成密度為1×107/mL的H22細胞懸液。用臺盼藍計數法，顯微鏡下觀察并計數活細胞數＞95%，以0.2 mL/只接種于昆明小鼠右腋皮下，制備H22肝癌實體模型[1]。

2.2 分組及給藥

2.2.1 分 組 荷瘤小鼠造模24h后，將動物隨機分為正常組、模型組、陽性對照組（CTX組）、水提組（RSEL）、總多糖組（PRSEL）、小分子組（SRSEL），每組10只。

2.2.2 給 藥 按《中藥藥理實驗方法學》附表“人和動物間接體表面積折算表”，計算出各組給藥劑量，人參二苓湯總多糖組用水提醇沉法提取其中多糖部分，Sevege法去除其中的游離蛋白，獲得人參二苓湯復方總多糖，水提醇沉上清液為人參二苓湯小分子部分，分別旋干低溫保存備用，以及水提物的旋干物，最后三組給藥劑量都控制在2.925g/kg，用生理鹽水稀釋灌胃給藥，最后每組每天分別均給藥0.4mL/只。H22荷瘤小鼠造模成功24h后，人參二苓湯各部分組開始灌胃給藥0.4mL/只，陽性對照組給予環磷酰胺（CTX）0.4mL/只（50mg/kg），腹腔注射，隔天給藥，模型對照組和正常組給予生理鹽水灌胃0.4mL/只，每天1次，連續給藥14天。

2.3 相關指標檢測 第15天稱取小鼠質量，在無菌條件下摘眼球取血于抗凝EP管，檢測血細胞含量。解剖死亡小鼠，稱取脾胸腺質量，計算脾胸腺指數及抑瘤率。器官指數=器官質量/體質量×1000（mg/g）；抑瘤率（%）=［（對照組平均瘤重-治療組平均瘤重）/對照組平均瘤重］×100%。

2.4 統計學方法 應用SPSS19.0軟件，實驗數據以均數±標準差（±s） 表示，采用單因素方差分析。

3 實驗結果

3.1 人參二苓湯及其水提醇沉提取物對H22荷瘤小鼠腫瘤生長的影響 與模型組比較，RSEL組及PRSEL組對腫瘤質量均具有顯著降低作用（P＜0.01）；與RSEL組比較，PRSEL組小鼠瘤質量降低更顯著（P＜0.05），RSEL組和 PRSEL組抑瘤率分別為37.80%，50.13%。見表1。

3.2 人參二苓湯及其水提醇沉提取物對H22荷瘤小鼠脾胸腺指數的影響 與正常組比較，RSEL組、PRSEL組脾臟和胸腺指數提高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，RSEL組、PRSEL組胸腺指數增高（P＜0.01），SRSEL組胸腺指數變化不大（P＞0.05）。與模型組比較，人參二苓湯RSEL組和PRSEL組荷瘤小鼠脾臟指數差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表1 人參二苓湯及其水提醇沉提取物對H22荷瘤小鼠腫瘤

表2 人參二苓湯及其水提醇沉提取物對H22荷瘤小鼠脾、胸腺指數的影響（mg/g，±s）

表2 人參二苓湯及其水提醇沉提取物對H22荷瘤小鼠脾、胸腺指數的影響（mg/g，±s）

注：與正常組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與CTX組比較，▲P＜0.01；CTX：環磷酰胺；RSEL：人參二苓湯水提；PRSEL：人參二苓湯復方總多糖；SRSEL：人參二苓湯小分子部分

組別正常組荷瘤模型組CTX組RSEL組PRSEL組SRSEL組鼠數10 10 10 10 10 10脾指數8.11±0.31 8.78±2.43 7.68±2.10 12.04±1.65**△▲13.62±2.02**△▲10.26±1.54△胸腺指數2.26±0.24 2.45±0.35 1.84±0.33 3.09±0.70*△▲3.66±0.76**△▲2.91±0.62

3.3 人參二苓湯及其水提醇沉提取物對H22荷瘤小鼠外周血WBC、PLT數量的影響 與模型組比較，人參二苓湯總多糖及水提物改善小鼠外周血WBC含量均較為顯著（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組紅細胞、血小板變化差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 人參二苓湯及其水提醇沉提取物對H22荷瘤小鼠外周血WBC、RBC、PLT數量的影響（±s）

表3 人參二苓湯及其水提醇沉提取物對H22荷瘤小鼠外周血WBC、RBC、PLT數量的影響（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01；與RSEL組比較，△P＜0.01；CTX：環磷酰胺；RSEL：人參二苓湯水提；PRSEL：人參二苓湯復方總多糖；SRSEL：人參二苓湯小分子部分

組別正常組荷瘤模型組CTX組RSEL組PRSEL組SRSEL組鼠數10 10 10 10 10 10 WBC（109/L）5.55±1.45 28.86±9.93 8.56±3.43 11.19±6.35** 8.85±3.91**△35.58±7.36 RBC（1012/L）10.23±1.55 6.84±0.54 6.06±1.10 7.45±1.56 7.47±1.92 7.55±0.77 PLT（109/L）1611.25±469.34 1774.60±253.03 1339.83±326.77 1652.25±311.40 1607.44±413.16 2081.60±410.00

4 討 論

相關研究表明，中藥多糖具有抗病毒以及抗腫瘤等生理活性[2]。目前單味中藥的多糖研究較多，復合多糖研究正在被關注。人參二苓湯由生曬參、豬苓、茯苓、薏苡仁、蟬蛻、防風、白術、甘草組成，具有補氣健脾、燥濕利水等功效。前期臨床研究[3-6]該方對于腫瘤相關疾病的免疫調節療效均較為顯著。本實驗結果在一定程度上證實人參二苓湯復合多糖改善荷瘤小鼠脾和胸腺的功能，且效果優于水提物組及小分子組（P＜0.05）。

多糖的免疫調節作用是通過宿主中介途徑，且大多無細胞毒性，并不影響正常細胞，誘導細胞因子的產生和受體的表達，同時刺激機體的免疫活性細胞的成熟分化以及繁殖，調節荷瘤小鼠失衡的免疫狀態[7-8]。人參二苓湯總多糖可能通過提高晚期荷瘤小鼠免疫功能來明顯改善白細胞水平，維持一個相對穩定的血細胞數量，延遲類白血病樣反應的發生，從而延長荷瘤小鼠的生存期。人參二苓湯總多糖改善荷瘤小鼠免疫機制有待更進一步的研究和證實。

［1］吳先闖，杜鋼軍，宋曉勇，等.玉米須多糖對環磷酰胺治療H22荷瘤小鼠機體損傷的減毒增效作用［J］.中藥材，2014，37（10）：1833-1836.

［2］Yan H，Xie YP，Sun SG，et al.Chemical analysis of Astragalus mongholicus polysaccharides and antioxidant activity of the polysaccharides［J］.Carbohyd Polym，2010，82（10）：636-640.

［3］金莉，傅華洲.人參二苓湯防治胃癌化療后不良反應及其對免疫功能的影響［J］.中華中醫藥學刊，2012，21（5）：1182-1184.

［4］傅大治.人參二苓湯聯合替吉奧膠囊治療晚期胃癌56例臨床觀察［J］.中國中醫藥科技，2012，19（2）：168-169.

［5］傅大治.人參二苓湯聯合培美曲賽、卡鉑治療晚期非小細胞肺癌46例臨床觀察［J］.浙江中醫藥大學學報，2012，36（9）：998-1000.

［6］傅大治.人參二苓湯聯合厄洛替尼治療晚期非小細胞肺癌臨床觀察［J］.中華中醫藥學刊，2013，31（2）：442-443.

［7］Kim HS，Kim YJ，Lee HK，et al.Activation of macrophages by polysaccharide isolated from Paecilomyces cicadae through toll-like receptor 4［J］.Food and Chemical Toxicology，2012，50（9）：3190-3197.

［8］Schepetkin IA，Quinn MT.Botanical polysaccharides：macrophage immunomodulation and therapeutic potential［J］. International Immunopharmacology，2006，6（3）：317-333.

（收稿：2015-10-26 修回：2015-11-24）

Effects of Renshen Erling Decoction and Its Water Extract from Alcohol Precipitation on Spleen Index and Thymus Index and Peripheral Blood Cells of H22 Tumor-bearing Mice

CHENG Quan1,FU Huazhou21Second Clinical College,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;2 Department of TCM, First People's Hospital of Hangzhou,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the Renshen Erling decoction and its water extract from alcohol precipitation on spleen index and thymus index and peripheral blood cells in H22 tumor-mice.MethodsSixty healthy KM mice were randomly divided into 6 groups:control group,tumor-bearing model group,positive control group （CTX group）,Renshen Erling decoction-water extract group（RSEL）,Renshen Erling decoction-total polysaccharide group（PRSEL）,and Renshen Erling decoction-small molecule group（SRSEL）,with 10 mice in each group.H22 tumor-bearing model was established in all group except control group,then mice in each group were treated with the corresponding drugs for 14d.On day 15,mice in each group were sacrificed for calculation of spleen and thymus index and inhibitory rate and counting of peripheral blood cells.ResultsThe inhibitory rate were 37.80%, 50.13%,and 79.62%in RSEL group,PRSEL group and CTX group,respectively;the average tumor weight in CTX group,RSEL group,and PRSEL group were 0.7611±0.1502g,2.3231±0.5324g and 1.8642±0.5740g,respectively, with a significant difference compared to tumor-bearing model group（3.7352±0.4851g,P＜0.01）;no significant difference was found between that of SRSEL group（3.5072±0.278g）and tumor-bearing model group（P＞0.05）;a significant difference was noted between RSEL group and PRSEL group（P＜0.05）.The spleen index and thymus index of PRSEL group were higher than that of tumor-bearing model group（P＜0.05 or P＜0.01）and even higher than thatof RSEL and SRSEL groups.The excessive increase of leucocyte in advanced tumor-bearing mice was inhibited in PRSEL group（P＜0.01）and the inhibition effect was better compared to that in RSEL group（P＜0.05）.ConclusionRenshen Erling decoction-PRSEL can significantly delay the leukemoid reaction of tumor-bearing mice and maintain their blood cells in a relatively stable state.Its effect on inhibiting tumor growth is clear,which may be related to its role in improving the function of immune organs in mice.

H22 tumor-bearing mice;Renshen Erling decoction;total polysaccharide;peripheral blood cells

浙江省中醫藥科技計劃項目（No.2013ZA105）

1浙江中醫藥大學第二臨床醫學院（杭州 310053）；2杭州市第一人民醫院中醫科（杭州 310006）

傅華洲，E-mail：fuhuazhou@126.com