抗肝癌合劑對荷肝癌H22小鼠腫瘤細胞周期的影響

錢 玥周維順

抗肝癌合劑對荷肝癌H22小鼠腫瘤細胞周期的影響

錢 玥1周維順2

目的觀察抗肝癌合劑對荷肝癌H22小鼠移植瘤的生長及腫瘤細胞周期分布的影響。方法60只昆明小鼠隨機分為模型組、抗肝癌合劑高、中、低劑量組、氟尿嘧啶組（5-FU組）和抗癌合劑中劑量+氟尿嘧啶組（中劑量+5-FU組），將H22腹水型瘤細胞懸液接種至昆明小鼠右腋窩皮下制備局灶性腫瘤模型，分組灌胃給藥。10天后，小鼠剝離移植瘤，稱取瘤重，計算抑瘤率，流式細胞儀檢測分析細胞周期情況，計算細胞增殖指數。結果抑瘤率：抗肝癌合劑低、中、高劑量組及5-Fu組、中劑量+5-Fu組分別為0.64%、15.17%、15.08%、64.86%、66.33%；平均瘤重：低劑量組與模型組無明顯差異[（1.3133±0.2840）g比（1.3217±0.2929）g，P＞0.05]；中、高劑量組比模型對照組降低[（1.1212±0.1928）g、（1.1224±0.1772）g比（1.3217±0.2929）g，P＜0.05]，但兩組間無差異[（1.1212± 0.1928）g比（1.1224±0.1772）g，P＞0.05]；5-Fu組、中劑量+5-Fu組比模型對照組降低[（0.4645± 0.0923）g、（0.4450±0.1085）g比（1.3217±0.2929）g，P＜0.01]；各用藥組均能使腫瘤組織細胞阻滯于G0/G1期，表現為G0/G1期細胞增多，S、G2/M期細胞相應減少，細胞增殖指數PI各用藥組均小于模型對照組，低劑量組與模型對照組比較差異無統計學意義[（64.18±8.35）%比（69.10±4.39）%，P＞0.05]；其余各組與模型對照組比較[（56.60±7.87）%、（54.30±7.08）%、（47.61±9.66）%、（40.83±9.92）%比（69.10±4.39）%]差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。結論抗肝癌合劑對荷肝癌H22小鼠腫瘤的生長有明顯的抑制作用，使腫瘤組織細胞阻滯于G0/G1期。

小鼠；肝癌；細胞周期；抗肝癌合劑

原發性肝癌（Primary hepatic carcinoma，PHC）是最常見的惡性腫瘤之一，近年發病率和死亡率均有所增加[1-2]。目前治療肝癌的方法包括手術切除、肝移植等[3]。研究表明，中醫藥在穩定瘤灶、增加機體免疫功能、改善患者臨床癥狀、減輕放化療毒副作用、延長帶瘤生存時間等方面均具有優勢[4]。周維順教授從事中西醫結合腫瘤內科工作40余年，根據中醫對肝癌病因病機的認識和自身長期的臨床經驗，以清熱解毒、疏肝理氣為主要原則組方，制備成抗肝癌合劑，經過臨床實踐證實，抗肝癌合劑對穩定瘤體生長、改善患者癥狀體征、提高其生存質量、延長生存期以及放化療后的減毒增效均有較肯定的療效。本研究旨在探討該方抗腫瘤的作用機制，報道如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康昆明（KM）種小鼠60只，8周齡，雄性，體質量（20.0±2.0）g，清潔級（由浙江中醫藥大學醫學實驗動物中心代購，動物合格證號：SCXK（滬）2014-0002）。小鼠群養，每籠5只，實驗期間自由飲食，標準飼料由浙江中醫藥大學醫學實驗動物中心提供。實驗室室溫18～22℃，相對濕度40%～60%。

1.2 瘤源動物 已接種H22腹水型肝癌細胞7天，腹水生長良好的昆明小鼠3只（購自中國科學院上海細胞生物研究所）。

1.3 實驗藥品 抗肝癌合劑（白花蛇舌草、半枝蓮、貓人參、貓爪草各30g，豬苓、茯苓各15g，靈芝、焦山楂、蒲公英各30g，柴胡、赤芍、白芍、莪術各10g,廣郁金12g，原始處方單貼總劑量為292g，由浙江中醫藥大學風濕免疫實驗室制備成高劑量組濃度，為每毫升含生藥2.42g，4℃冰箱保存備用）；注射用氟尿嘧啶（5-Fu，購自浙江省中醫院，南通精華制藥有限公司，批準文號：國藥準字H32022246，規格：10mL：0.25g）。

2 實驗方法

2.1 造 模 無菌條件下操作，取接種10天的H22肝癌腹水型小鼠腹水，加生理鹽水稀釋成瘤細胞懸液濃度為1×107個瘤細胞/mL。昆明小鼠皮下接種瘤細胞懸液0.2mL，制備局灶性腫瘤模型。

2.2 分 組 60只KM小鼠分別稱重，參照隨機對照數字表隨機分成模型組、抗肝癌合劑高劑量組（高劑量組）、抗肝癌合劑中劑量組（中劑量組）、抗肝癌合劑低劑量組（低劑量組）、氟尿嘧啶組（5-Fu組）及抗肝癌合劑中劑量+氟尿嘧啶組（中劑量+5-Fu組），每組10只，分籠飼養，每籠以不同部位方式標記（頭、背、尾、左前、左后、右前、右后、空白）。

2.3 給 藥 以成人用量折算成小鼠低劑量組[5]的用藥量得出5-Fu為0.5mg/20g，中藥為1.168g/20g，先確定中藥中劑量組給藥量，高、中、低劑量差為2的等比級數。實驗動物瘤株接種后24h（即次日10am）開始分組給藥，灌胃容積均為0.4mL/20g，每天給藥2次，連續灌胃10天，共計給藥10次。中劑量+ 5-Fu組的中藥給藥量及方式同中藥中劑量組，5-Fu給藥量及方式同5-Fu組。

2.4 觀察指標 （1）對腫瘤生長的影響：實驗第11天（即末次給藥后24h）小鼠脫頸椎處死，剝離腋窩皮下腫瘤，稱量瘤重，計算抑瘤率。抑瘤率%=模型組平均瘤重-實驗組平均瘤重/模型平均瘤重×100%；（2）對腫瘤組織細胞周期的影響：采用流式細胞技術，計算G0/G1、S、G2/M在細胞周期中所占的百分比及細胞增值指數PI（proliferous index）值，PI%=[（S+G2/M）÷（G0/G1+S+G2/M）]×100%，最后通過Modfit軟件分析數據。

2.5 統計學方法 應用SPSS16.0統計軟件進行數據分析；計量資料數據用均數±標準差（±s） 表示，多組間均數比較采用方差分析，兩組間均數比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 腫瘤生長情況 全部小鼠接種后，均有皮下結節生長，各用藥組小鼠的皮下結節均較模型組為小。實驗過程中，5-FU組死亡1只。低劑量組抑瘤效果不明顯，抑瘤率只有0.64%，平均瘤重與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；中、高劑量組抑瘤率分別為15.17%、15.08%，平均瘤重與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），但兩組間差異無統計學意義（P＞0.05）；5-Fu組與中劑量+5-Fu組抑瘤率相近，分別為64.86%、66.33%，平均瘤重亦相近，但與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；與5-Fu組比較，中劑量+5-Fu組平均瘤重更小，抑瘤率更高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠平均瘤重和抑瘤率比較

3.2 接種部位瘤結節（組織）細胞周期分布 各用藥組小鼠接種部位瘤結節（組織）細胞周期分布較模型組均呈現明顯細胞G0/G1期阻滯，表現為G0/G1期細胞增多（P＜0.01），S、G2/M期細胞相應減少（P＜0.05 或P＜0.01）。S期：5-Fu組、中劑量+5-Fu組與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；G2/M期：低劑量組與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），中、高劑量組顯著低于模型組（P＜0.05），5-Fu組、中劑量+5-Fu組與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。細胞增殖指數PI：各組均較模型組為小，低劑量組與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；其余各組與模型組比較差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表2，圖1～6（封二）。

4 討論

中醫認為，肝失疏泄容易引起氣機郁滯，甚至氣機上逆，氣有余便是火。肝臟特性為陽常有余，陰常不足，陽盛則熱。因此，熱毒是肝癌癌毒發生、發展的重要病理因素；導致熱毒產生的因素眾多，熱毒生成之后又可與其他病理因素互相影響，既是肝癌的致病因素，又是其病理產物[6]。周維順教授根據肝癌外感火熱侵襲，熱毒凝結為主的病機，以及肝本身“體陰用陽”的屬性，治療以清熱解毒大法為主，佐以疏肝理氣，益氣養陰，確立抗肝癌合劑復方，方中白花蛇舌草、半枝蓮、貓人參、貓爪草、豬苓、茯苓、蒲公英等均為清熱解毒利濕抗癌之品，為主藥；柴胡疏解肝郁、與芍藥養血斂陰柔肝，一升一斂相配；熱毒郁滯，肝氣郁結，血行不暢，加以廣郁金、莪術共奏疏肝解郁，行氣活血之效；熱毒能損傷氣陰，靈芝能益氣養陰，扶正抗癌；過用苦寒之品易敗胃傷脾，焦山楂可健脾和胃。諸藥合用，有清熱解毒抗癌、疏肝行氣解郁、扶正養陰祛邪之功。全方配伍精良，以清熱解毒利濕治其濕熱，疏肝行氣解郁散其郁結，輔以益氣養陰扶其正氣，健脾和胃顧護胃氣，祛邪而不傷正，標本兼顧。

惡性腫瘤區別于良性腫瘤的一個重要特征是其失控性的增殖[7]。由于腫瘤細胞周期“start”位點的失控，大量G0期細胞無限制地通過G1/S和G2/M轉換，最終導致細胞的異常增殖，細胞核DNA含量異常，DNA倍體異常或在細胞周期中S期細胞增多,而腫瘤細胞一旦進入S期即開始DNA合成，無特殊干擾，便能按細胞周期的順序不斷增殖發展。

本實驗結果顯示，各用藥組實驗小鼠的接種部位瘤結節（組織）的瘤重均小于對照組，抑瘤率明顯提高，而各用藥組的細胞周期分布較模型組均呈現明顯的細胞G0/G1期阻滯，表現為G0/G1期細胞增多，S、G2/M期細胞相應減少；抗癌合劑單藥組的效果呈一定的劑量相關性，而中劑量+5-FU組的作用明顯優于抗癌合劑單藥組及5-FU組。因此，我們推斷，抗肝癌合劑有明確的抗癌作用，且與劑量相關；抗肝癌合劑可能增強5-FU的抗腫瘤效應，其抗癌機制之一可能是抗肝癌合劑促使腫瘤細胞阻滯于G0/ G1期，但其他作用機制還有待于進一步研究。

表2 各組小鼠腫瘤組織細胞周期比較（%，±s）

表2 各組小鼠腫瘤組織細胞周期比較（%，±s）

注：與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別模型組低劑量組中劑量組高劑量組5-Fu組中劑量+5-Fu組鼠數10 10 10 10 9 10細胞周期分布G0/G1 30.90±4.39 35.82±8.35 43.40±7.87△△45.71±7.08△△56.43±5.29△△59.17±9.92△△S 41.98±9.98 41.01±7.50 37.15±8.01 35.98±7.08 31.61±7.46△△29.07±5.87△△G2/M 27.12±9.71 23.17±7.42 19.45±6.60△18.32±8.85△12.53±8.86△△11.76±8.91△△PI 69.10±4.39 64.18±8.35 56.60±7.87△△54.30±7.08△△47.61±9.66△△40.83±9.92△△

［1］Quivrin M，Momex F，Enachescu C，et al.Primary liver cancer［J］.Cancer Radiother，2010，14（Suppl 1）：103-110.

［2］孫燕，石遠凱.臨床腫瘤內科手冊［M］.第5版.北京：人民衛生出版社，2012：470.

［3］Liu L，Zhu XD，Wang WQ，et al.Activation of beta-catenin by hypoxia in hepatocellular carcinoma contributes to en-hanced metastatic potentialand poor prognosis［J］.Clin CancerRes，2010，16（10）：2740-2750.

［4］王錦鴻.中醫在治療惡性腫瘤中的地位和作用［J］.江蘇中醫，2012，22（11）：1-3.

［5］陳奇.中藥藥理研究方法學［M］.第3版.北京：人民衛生出版社，2011：1235.

［6］姜家康，陳瑞睿，劉洪星，等.關于“肝之癌毒”理論的簡述［J］.中醫藥信息，2012，29（4）：12-13.

［7］湯釗猷.現代腫瘤學［M］.第3版，上海：復旦大學出版社，2011：139.

（收稿：2016-01-18 修回：2016-03-11）

Effect of Melting Agent of Anti-Liver Cancer on the Mitotic Cycle of Tumor Cells in H22 Tumor-bearing Mice

QIAN Yue1,ZHOU Weishun2. 1First and Second Ward,Wuyun Mountain Sanatorium of Hangzhou(310008), China;2Zhejiang Provincial Hospital of TCM,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo observe the effect of melting agent of anti-liver cancer（MAALC）on the tumor growth and the mitotic cycle of H22 tumor-bearing mouse model.MethodsSixty KM mice were randomly divided into model group,low-dose,mid-dose,and high-dose MAALC groups,5-FU group,and mid-dose MAALC+5-FU group. All mice were inoculated with the H22 liver cancer cell at right armpit,then treated with the corresponding medicine for 10 d.And then all mice were killed to detach the tumor.The detached tumors were weighted and the inhibitory rate were calculated.The mitotic cycle of tumor cells was analyzed by flowcytometry and the proliferation index were calculated.ResultsThe inhibitory rates low-dose,mid-dose,and high-dose MAALC groups,5-FU group and MAALC+5-FU group were 0.64%,15.17%,15.08%,64.86%,66.33%.Compared with that in model group（1.3217±0.2929g）,the average tumor in low-dose MAALC group was not different（1.3133±0.2840,P＞0.05）, but that in mid-dose and high-dose MAALC groups were lighter（1.1212±0.1928,1.1224±0.1772,P＜0.05）;no significant difference was found between the two groups（P＞0.05）;that in 5-FU group and MAALC+5-FU group were significant lighter（0.4645±0.0923,0.4450±0.1085,P＜0.01）.MAALC hindered the tumor cell in the G0/G1 phase, that is,the G0/G1 cells increased,while the S and G2/M cells correspondingly decreased.Compared with that in model group（69.10%±4.39%）,the proliferation index in mid-dose MAALC,high-dose MAALC,5-FU,and MAALC+5-FU groups（56.60%±7.87%,54.30%±7.08%,47.61%±9.66%,40.83%±9.92%;P＜0.05 or P＜0.01）were significantly lower except for that in low-dose MAALC group（64.18%±8.35%,P＞0.05）.ConclusionMAALC canobviously restrain the growth of tumor and hinder the tumor cell in the G0/G1 phase.

mice;liver cancer;mitotic cycle;MAALC

·經驗交流·

浙江省教育廳資助項目（No.B0613）

1杭州五云山療養院一二療區（杭州 310008）；2浙江省中醫院腫瘤科（杭州 310006）

錢玥，Tel：13516811226；E-mai：66182119@qq.com