自噬在丹參酮ⅡA減輕內毒素性急性肺損傷中的作用及相關機制研究

周煒棟楊蒙召陳 曄

·實驗研究·

自噬在丹參酮ⅡA減輕內毒素性急性肺損傷中的作用及相關機制研究

周煒棟1楊蒙召1陳 曄2

目的探討自噬在丹參酮ⅡA減輕內毒素性急性肺損傷中的作用及相關機制。方法將32只SD雄性大鼠隨機分為正常對照組、模型組、丹參酮ⅡA組和3-MA組（自噬抑制組）。通過氣管內滴入0.05%內毒素（LPS）溶液0.02mL建立大鼠急性肺損傷模型及腹腔預注射自噬抑制劑3-MA（15mg/kg）或丹參酮ⅡA（1mL/kg·d）后摘取肺組織，免疫組化法檢測肺組織病理改變，ELISA法檢測TNF-α、IL-6、IL-10水平，Western blot檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ及泛素相關蛋白SQSTM1/ P62水平。結果免疫組化示模型組肺泡間隔增厚，肺泡腔狹窄，大量炎癥細胞滲出；丹參酮IIA組則明顯改善；3-MA組抑制自噬后肺泡炎癥細胞滲出明顯。與對照組比較，模型組LC3-Ⅱ灰度值明顯升高（4954.39±433.62比2408.66±250.12，P＜0.05），SQSTM1/P62灰度值下降（2316.21±274.71比4176.72±422.05，P＜0.05），炎癥因子TNF-α[（11.00±1.43）pg/mL比（3.30±0.75）pg/mL、IL-6（41.89± 8.82）pg/mL比（21.89±2.83）pg/mL、IL-10（91.34±16.94）pg/mL比（28.15±6.91）pg/mL]濃度升高（P均＜0.05）；與模型組比較，丹參酮IIA組LC3-Ⅱ灰度值顯著升高（6064.37±552.26比4954.39±433.62，P＜0.05），SQSTM1/P62灰度值下降（1233.33±143.72比2316.21±274.71，P＜0.05），炎癥因子[TNF-α （8.98±1.27）pg/mL比（11.00±1.43）pg/mL、IL-6（33.07±5.15）pg/mL比（41.89±8.82）pg/mL、IL-10 （59.76±19.25）pg/mL比（91.34±16.94）pg/mL]濃度下降（P均＜0.05）；與丹參酮IIA比較，3-MA組LC3-Ⅱ灰度值下降（1558.71±177.16比6064.37±552.26，P＜0.05），SQSTM1/P62升高（4360.06± 464.31比1233.33±143.72，P＜0.05），炎癥因子[TNF-α（11.08±1.58pg）/mL比（8.98±1.27）pg/mL、IL-6 （39.87±5.13）pg/mL比（33.07±5.15）pg/mL、IL-10（77.52±9.28）pg/mL比（59.76±19.25）pg/mL]濃度升高（P均＜0.05）。結論丹參酮ⅡA可能通過增強內毒素性急性肺損傷大鼠的自噬水平，減輕內毒素性急性肺損傷。

大鼠；自噬；丹參酮ⅡA；內毒素；急性肺損傷；炎癥因子

內毒素所致急性肺損傷（acute lung injury，ALI）[1]是呼吸系統常見的危重癥。丹參酮ⅡA是中藥丹參的主要活性成分，具有抗凝、抗炎、抗黏附作用[2]。研究[3]表明，丹參酮ⅡA對急性肺損傷具有保護作用。自噬（autophagy）是細胞內可溶性的大分子物質（如核酸，蛋白質，碳水化合物和脂質）及功能失調的細胞器（如線粒體，核糖體，過氧化物酶體和內質網）高度保守的非特異性降解過程[4]。微管相關后自輕鏈3 （LC3）是自噬相關基因（autophagy-related gene，ATG）8表達的產物,分為Ⅰ型和Ⅱ型。當自噬發生時，Ⅰ型經泛素樣修飾與磷脂酰乙醇胺結合，定位于自噬體膜上，形成LC3-Ⅱ，其被認為是自噬體的標志分子。P62是由原癌基因c-myc編碼的蛋白，當自噬發生時，P62與泛素化蛋白結合，再與自噬體膜上的LC3-Ⅱ蛋白形成復合物，并被運送至自噬溶酶體中降解，因此，當自噬發生時，P62水平下降；自噬受抑制時，P62水平增高。文獻[5-6]報道，自噬可以清除病理性炎癥反應產物從而減輕其對細胞或細胞器的損傷。本研究探討自噬在丹參酮ⅡA減輕內毒素性急性肺損傷中的作用及相關機制。

1 實驗材料

1.1 動 物 清潔級SD大鼠32只，雄性，體質量（210±15）g，浙江中醫藥大學動物實驗中心提供，動物許可證號：X10C2168。所有SD大鼠分籠飼養，標準規格的嚙齒類食物喂養，自由飲水，室內溫度控制在（21±2）℃，濕度控制在（55±2）%。

1.2 材 料 內毒素（LPS）、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）購自美國 Sigma公司（批號20140121，20130809）；抗LC3-Ⅱ多克隆抗體購自美國Novus公司（NB600-1384）；GAPHD、SQSTM1/p62抗體購自美國CST公司（批號20131204，20130913）；TNF-α、IL-6、IL-10酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測試劑盒購自美國R&D公司（批號20140112，20131109，20131211）；丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液購自上海第一生化藥業有限公司（批號20140305）。

2 實驗方法

2.1 分組及模型制備 將32只實驗用清潔級SD大鼠編號后按隨機數字表法隨機分為四組：正常對照組；模型組：參照文獻[6]方法，在大鼠氣管內滴入0.05%的LPS溶液0.02mL；丹參酮IIA組：在內毒素性急性肺損傷造模后連續7天給予大鼠腹腔注射1mL/（kg·d）的丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液；3-MA組（自噬抑制組）：在建立內毒素性急性肺損傷模型前30min先給予大鼠腹腔注射15mg/kg的自噬抑制劑（3-MA），造模后連續7天再給予大鼠腹腔注射1mL/ （kg·d）的丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液。

2.2 免疫組化 4%多聚甲醛固定取下的肺組織，用梯度乙醇溶液進行脫水后石蠟包埋，切片。二甲苯60℃ 20min脫蠟，梯度乙醇溶液水化后烘干、蘇木精-伊紅（HematoxylinEosin，HE）染色，光鏡下觀察各組大鼠肺病理組織形態學改變。

2.3 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測LC3-Ⅱ和SQSTM1/p62表達 取適量肺組織，加入液氮后在攆缽中攆成粉末，倒入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液

3 實驗結果

3.1 丹參酮ⅡA及自噬對LPS誘導的大鼠急性肺損傷的保護作用 免疫組化顯示，對照組大鼠肺組織結構正常，肺泡結構清晰；模型組肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔狹窄，腔內可見出血及大量炎癥細胞浸潤。內毒素LPS成功誘導了大鼠急性肺損傷。丹參酮ⅡA組免疫組化顯示大鼠肺泡結構趨于正常，肺泡腔出血減少，炎癥細胞浸潤減輕。與丹參酮ⅡA組比較，3-MA組（自噬抑制組）各種肺損傷表現嚴重：肺泡腔明顯狹窄，出血增多，腔內可見大量炎癥細胞的浸潤（插頁圖1）。

3.2 四組大鼠LC3-Ⅱ、SQSTM1/P62表達量比較

蛋白免疫印跡分析自噬相關蛋白的表達情況，與對照組比較，模型組自噬相關蛋白LC3-Ⅱ表達量增加（P＜0.05），SQSTM1/p62表達降低（P＜0.05），自噬水平增強；與模型組比較，丹參酮ⅡA組LC3-Ⅱ表達量升高（P＜0.05），SQSTM1/p62明顯降低（P＜0.05），自噬水平進一步增強；與丹參酮ⅡA組比較，3-MA組（自噬抑制組）LC3-Ⅱ表達量降低（P＜0.05），SQSTM1/p62表達升高（P＜0.05），自噬水平下降。見表1-2、圖2（插頁）。

3.3 四組大鼠血漿炎癥因子表達比較 與對照組比較，模型組大鼠血漿TNF-α、IL-6、IL-10表達量明顯增多（P均＜0.05）；丹參酮ⅡA組TNF-α、IL-6、IL-10表達量較模型組下降（P均＜0.05）；3-MA組（自噬抑制組）TNF-α、IL-6、IL-10表達較丹參酮ⅡA組增加（P均＜0.05）。見表3。中在冰上裂解30min，每隔10min震蕩1次，13 300r/ min離心12min后取上清液，BCA法進行蛋白定量。樣本中加入5×loading上樣緩沖液并等體積補水后置于電飯鍋內煮沸7min。每個樣本取60μg進行SDS-PAGE凝膠電泳，跑完后轉印至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉2h，在4℃冰箱中分別孵育GAPDH、LC3-Ⅱ和SQSTM1/p62抗體過夜。TBS-T洗3次后加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2h，ECL法顯影并在富士LAS-4000曝光機上讀取圖像。

2.4 ELISA檢測血漿TNF-α、IL-6、IL-10水平 采用酶聯免疫吸附法檢測，步驟按說明書進行。

表1 四組大鼠LC3-Ⅱ表達量比較（±s）

表1 四組大鼠LC3-Ⅱ表達量比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與丹參酮ⅡA組比較，▲P＜0.05

只數組別對照組模型組丹參酮ⅡA組3-MA組3 3 3 3 LC3-Ⅱ2408.66±250.12 4954.39±433.62* 6064.37±552.26△* 1558.71±177.16▲GAPDH 6984.45±704.34 5701.04±565.32 5577.45±585.53 8354.62±755.11 LC3-Ⅱ/GAPDH 0.345 0.869 1.087 0.186

表2 四組大鼠P62表達量比較（±s）

表2 四組大鼠P62表達量比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與丹參酮ⅡA組比較，▲P＜0.05

組別對照組模型組丹參酮ⅡA組3-MA組只數3 3 3 3 P62 4176.72±422.05 2316.21±274.71* 1233.33±143.72△4360.06±464.31▲GAPDH 6667.73±697.59 8006.09±778.38 7284.35±688.18 7407.54±783.28 P62/GAPDH 0.626 0.289 0.169 0.589

表3 各組炎癥因子表達比較（pg/mL±s）

表3 各組炎癥因子表達比較（pg/mL±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與丹參酮ⅡA組比較，▲P＜0.05

IL-10 28.15±6.91 91.34±16.94* 59.76±19.25*△77.52±9.28▲組別對照組模型組丹參酮ⅡA組3-MA組只數8 8 8 8 TNF-α 3.30±0.75 11.00±1.43* 8.98±1.27*△11.08±1.58▲IL-6 21.89±2.83 41.89±8.82* 33.07±5.15*△39.87±5.13▲

4 討論

內毒素所致急性肺損傷的主要機制是內毒素活化多條細胞內的炎癥信號傳導通路[7]引起各種炎癥因子和炎癥介質的過度釋放,機體促炎與抗炎反應失平衡后大量炎癥細胞、炎癥因子和炎癥介質聚集和浸潤于肺部[8]，常導致肺血氣交換異常，換氣功能減退的病理過程，治療不及時可發展成為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）[9]甚至呼吸衰竭。丹參的主要成分丹參酮ⅡA對內毒素致炎癥細胞釋放高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein，HMGB1）[10]具有明顯的抑制作用，HMGB1一旦分泌到細胞外，即可發揮致炎作用[11]，因此丹參酮ⅡA可以通過調節促炎和抗炎因子平衡減輕炎癥介導的肺組織損害，在一定程度上緩解內毒素性急性肺損傷的發生發展。此外，目前認為內毒素的主要成分脂多糖可以誘導增強自噬水平[12]，而自噬可以通過清除已發生過度炎癥損傷或功能異常的細胞或細胞器[13]，從而保護正常的肺功能。

本研究結果顯示，模型組大鼠肺組織與對照組相比，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔狹窄，腔內可見出血及大量炎癥細胞浸潤。免疫印跡表明，模型組自噬相關蛋白LC3-Ⅱ表達增強，SQSTM1/p62減弱，丹參酮ⅡA進一步增強了急性肺損傷組織自噬水平。增強的自噬水平可能在丹參酮ⅡA減輕內毒素性急性肺損傷中具有保護作用。隨后的Elisa檢測結果亦顯示丹參酮ⅡA組較模型組炎癥水平減弱，而抑制自噬炎癥表達增強。

實驗結果顯示，丹參酮ⅡA可能通過調節炎癥水平，抑制炎癥因子、炎癥介質的釋放[14]，減輕內毒素性急性肺損傷的程度。自噬一方面可以降解因炎癥反應死亡或受損的細胞或細胞器等并重新利用，以維持細胞穩態。另一方面，自噬信號通路參與調控免疫應答和控制過度炎癥反應中也發揮著重要作用[15-16]：自噬通過與I型干擾素信號通路、TLR信號通路和炎性體之間的相互作用限制過度的炎性反應，保護正常的肺組織，減輕內毒素性急性肺損傷。

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（收稿：2015-09-10 修回：2015-12-20）

Beneficial Effects of Autophagy in Tanshinone IIA Reducing Endotoxin-induced Acute Lung Injury And Its Related Mechanisms

ZHOU Weidong1,YANG Mengzhao1,CHEN Ye2. 1Department of Respiratory Diseases,County Chinese Medical Hospital of Pingyang Zhejiang,Wenzhou(325401),China;2Department of Respiratory Diseases,Xinhua Hospital of Zhejiang,Hangzhou(310005),China

ObjectiveTo investigate the effect of autophagy in Tanshinone IIA reducing endotoxin-induced acute lung injury in rats and the underlying mechanism.MethodsThirty-two rabbits were randomly divided into 4 groups（n=8）:control group,acute lung injury model group,tanshinone IIA group,and autophagy inhibition group. Except for control group,rats in other groups were intratracheally given 0.02 mL of 0.05%lipopolysaccharide to establish the model of acute lung injury,then tanshinone IIA group and autophagy inhibition group were treated with intraperitoneal injection of tanshinone IIA（1mL·kg-1·d-1）and autophagy inhibitor 3-MA（15mg/kg）,respectively.After the treatment,lung tissue in each group were extracted for immunohistochemistry and the detection of TNF-α,IL-6,and IL-10 with ELISA and the measurement of autophagy related protein LC3-II and SQSTM1/P62 with Western blotting.ResultsHistopathologic examination showed edematous changes of thickening of alveolar walls, narrowed alveolar,and massive polymorphonuclear infiltration in model group.These changes in tanshinone IIA group were significantly alleviated,however,after 3-MA inhibited autophagy,obvious polymorphonuclear infiltration were observed.Compared with control group,the level of autophagy associated protein LC3-Ⅱincreased（4954.39± 433.62 vs 2408.66±250.12,P＜0.05）and SQSTM1/P62 decreased（2316.21±274.71 vs 4176.72±422.05,P＜0.05）and the levels of TNF-α（11.00±1.43pg/mL vs 3.30±0.75pg/mL）,IL-6（41.89±8.82pg/mL vs 21.89±2.83pg/mL）,IL-10 （91.34±16.94pg/mL vs 28.15±6.91pg/mL）increased in acute lung injury model group（all P＜0.05）.After the treatment of tanshinone IIA,the level of LC3-Ⅱ increased（6064.37±552.26）,SQSTM1/P62 decreased（1233.33±143.72）and the levels of TNF-α（8.98±1.27pg/mL）,IL-6（33.07±5.15pg/mL）,and IL-10（59.76±19.25pg/mL）decreased （compared with acute lung injury model group,all P＜0.05）.However,compared with tanshinone IIA group,the level of LC3-Ⅱin autophagy inhibition group decreased（1558.71±177.16）,SQSTM1/P62 increased（4360.06±464.31）, and the levels of TNF-α（11.08±1.58pg/mL）,IL-6（39.87±5.13pg/mL）,IL-10（77.52±9.28pg/mL）increaesed（all P＜0.05）.ConclusionTanshinone IIA can enhance the level of autophagy in endotoxin-induced acute lung injury,resulting in reduction of the injury.

rats;autophagy;tanshinone IIA;endotoxin;acute lung injury;inflammatory cytokines

國家自然科學基金青年項目（No.81302935）

1浙江省平陽縣中醫院呼吸內科（溫州 325401）；2浙江省新華醫院呼吸內科（杭州 310005）

陳曄，Tel：13588489515；E-mail：chenye1375@sina.com