響應面法優化椴樹蜂蜜蛋白提取工藝

謝博，傅紅，楊方

（1.海軍勤務學院，天津 300450；2.福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，福建 福州 350001；3.福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350108；4.福州大學福建省海洋酶工程重點實驗室，福建 福州 350108）

蜂蜜（honey）是蜜蜂將自己的唾液與采集的花蜜或昆蟲排泄物中獲取的蜜露混合，在巢脾內釀造而成的天然甜味物質，具有抗誘變、抗炎、美容養顏等多種營養和生物活性[1-3]。其成分豐富，除了含有大量的糖和芳香物質、有機酸等200多種生物活性物質之外，還含有蛋白質、氨基酸、酶等蛋白類物質[4-6]。蜂蜜蛋白類物質來源于蜜源植物或者蜜蜂本身，包括蜜蜂唾液腺和咽的分泌物、花蜜以及花粉，含量大約為0.1%～0.5%[2，7]。一般來說，蜂蜜中的氮含量很低，平均含量只有0.04%，其中40%～65%來源于蛋白質，剩余的氮含量主要來源于游離氨基酸，以脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸等7種氨基酸最常見[8-9]。研究表明，蜂蜜蛋白具有抗菌、抗氧化、生長抑制、提高免疫力等多種生物活性，且由于不同來源的蜂蜜所含蛋白不同，其已成為鑒定蜜源的重要依據之一[1，10-11]。因此，對于蜂蜜蛋白的研究越來越成為學者熱衷的研究方向之一。

目前提取蜂蜜蛋白質的方法主要是有機溶劑沉淀法以及鹽沉淀法[10，12-13]。周莉質等選取了三氯乙酸-丙酮法、鎢酸鈉沉淀法、硫酸銨沉淀法、尿素-硫脲法4種方法，探討適合雙向電泳的最優方法，尿素-硫脲法所得電泳圖譜更為清楚[14]。MOHAMMED等采用80%硫酸銨沉淀蜂蜜蛋白，進而研究蜂蜜與蜜源的關系[15]。Rückriemen等采用三氯乙酸沉淀法提取麥盧卡蜂蜜蛋白，研究麥盧卡蜂蜜和非麥盧卡蜂蜜的熒光性質[12]。KATRINA等采用瓊脂糖固定化的手段分離蜂蜜中的糖蛋白，所得蛋白進行抗菌活性研究[10]。綜合來看，學者們僅是采用相應的蜂蜜蛋白提取方法進行蜂蜜蛋白提取，而對蜂蜜蛋白提取工藝的優化研究較少，且蜂蜜蛋白是研究蜂蜜特性的基本物質之一，其得率直接影響后續試驗。因此，為對蜂蜜蛋白研究提供基礎，本研究應用響應面法對蜂蜜蛋白提取條件進行優化。

首先對比三氯乙酸沉淀法、乙醇沉淀法、硫酸銨沉淀法沉淀椴樹蜂蜜蛋白的蛋白含量，然后選擇較優方法進行單因素試驗，并采用響應面法對該方法沉淀椴樹蜂蜜蛋白進行工藝優化，得出椴樹蜂蜜蛋白提取最佳條件，為椴樹蜂蜜蛋白的深入研究提供理論基礎和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、丙酮、乙醇、磷酸、氫氧化鈉、硫酸銨（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白：上海麥克林生物公司；其余試劑均為國產分析純，所有溶液均以Milli-Q超純水系統制備的超純水為溶劑；蜂蜜為椴樹蜜：北京中蜜科技發展有限公司。

1.2 儀器與設備

CR21N臺式冷凍離心機：日立公司；88880018漩渦混合器：Thermo Scientific公司；UV-2700紫外-可見分光度計：島津儀器有限公司；Kjeltec 8400全自動定氮儀：FOSS公司；FreeZoneTriadTM2.5L冷凍干燥機：美國LABCONCO公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂蜜蛋白質提取

1.3.1.1 三氯乙酸沉淀法

稱取蜂蜜10.0 g溶于20%TCA水溶液中，將樣品在-20℃下保存30 min以使蜂蜜蛋白沉淀，沉淀后的溶液于5 000 r/min，4℃離心10 min，去除上清液，沉淀用10 mL超純水洗滌，再次離心。重復洗滌步驟，將最終的沉淀物溶解在2 mL超純水中，冷凍并隨后凍干[12]。

1.3.1.2 硫酸銨沉淀

將10.0 g蜂蜜溶解在10 mL緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl pH 7.5）中，并在 5 000 r/min，4℃下離心10 min以除去花粉粒。上清液用濃度為80%的硫酸銨在4℃下沉淀1 h，并以5 000 r/min，4℃離心10 min，收集蛋白質沉淀物并溶解在超純水中，透析24 h后凍干備用[15]。

1.3.1.3 乙醇沉淀法

取10.0 g蜂蜜溶解在10 mL超純水中，混勻并在4℃預冷；4℃條件下，向混勻的蜂蜜溶液中加入-20℃冷乙醇20mL，在冰浴上持續溫和地攪拌10min～15min，5 000 r/min，4℃離心10 min，棄去上清液并吸凈殘留液，所得沉淀即為蜂蜜蛋白質，沉淀復溶于超純水中，凍干備用[16]。

1.3.2 蛋白質含量測定

總蛋白含量參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》采用凱氏定氮法。采用考馬斯亮藍法（Bradford）測定提取物中蛋白質含量[17]。蜂蜜蛋白含量按式（1）計算。

式中：m1為提取物中蛋白質總質量，μg；m2為蜂蜜質量，g。

1.3.3 蜂蜜蛋白提取單因素試驗

以提取方法所得蜂蜜蛋白質含量為評價指標，比較不同因素對蜂蜜蛋白提取效果的影響。按料液比1∶2（g/mL），提取時間20 min，考察不同TCA濃度（10%、20%、30%、40%、50%）對蛋白提取的影響；料液比1∶2（g/mL），TCA濃度20%，考察不同提取時間（10、20、30、40、50 min）對蛋白提取的影響；提取時間30 min，TCA濃度20%，考察不同料液比[1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1∶5（g/mL）]對蛋白含量的影響。每組試驗重復3次。

1.3.4 響應面優化試驗

以單因素試驗得到的初步試驗結果為基礎，利用軟件Design Expert 8.05 Box-Behnken的中心組合原理，選取對蜂蜜蛋白提取影響較大的3個因素料液比（A）、TCA濃度（B）和提取時間（C）進行三因素三水平試驗，由此得出蜂蜜蛋白提取的最佳工藝條件。具體試驗因素和編碼水平見表1。

1.4 數據處理

采用 OriginPro9.0、Design－Expert 8.0.6 Trial進行數據處理與分析。

2 結果與分析

2.1 不同蜂蜜蛋白提取方法的選擇

利用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量的標準曲線方程為 Y=0.0107X+0.0643（R2=0.987），其中 X（μg/mL）為牛血清蛋白的濃度，Y（Abs）為吸光度。蜂蜜中總蛋白含量經凱氏定氮法測定為（0.16±0.03）g/100 g。

圖1顯示了TCA沉淀、乙醇沉淀、硫酸銨沉淀3種提取方法對蜂蜜蛋白提取的不同效果。

圖1 不同提取方法提取蜂蜜蛋白質Fig.1 Extraction of honey protein by different extraction methods

3種提取方法中TCA沉淀法所得蛋白質含量較高，為 75.12 μg/g，且耗時短，乙醇沉淀次之，為 34.01 μg/g，硫酸銨沉淀所得蛋白質最少，為8.42 μg/g。蜂蜜蛋白部分為糖蛋白，糖蛋白中糖鍵具有高度親水性，因此在水溶液中更易溶解，但硫酸胺難以使一些含糖豐富的糖蛋白沉淀[18]。而糖蛋白在三氯乙酸中溶解性更好，因此選取TCA沉淀法作為響應面優化的目標方法。

2.2 單因素試驗結果

提取時間對蜂蜜蛋白提取的影響見圖2。

圖2 提取時間對蜂蜜蛋白提取的影響Fig.2 Effect of extraction time on honey protein extraction

蜂蜜蛋白的含量會隨著提取時間的延長呈現出先增加后減少的趨勢（圖2）。20 min所得蛋白質含量最多，這可能是因為由于提取時間越長，有利于蜂蜜中的蛋白質溶解在溶劑中，但隨著提取時間延長，TCA溶液在-20℃會變為固體，影響蛋白質的沉淀行為且蛋白質沉淀也相對完全或發生變性降解等其它變化，導致提取的蛋白質含量變少[19]。結果表明，提取時間20min時，蜂蜜蛋白含量最大為96.55 μg/g，因此選取20 min作為響應面法優化蜂蜜蛋白提取時間的中心點。

TCA濃度對蜂蜜蛋白提取的影響見圖3。

圖3 TCA濃度對蜂蜜蛋白提取的影響Fig.3 Effect of TCA concentration on honey protein extraction

在5%～10%的濃度范圍內，所提蜂蜜蛋白質含量與三氯乙酸濃度呈正相關，三氯乙酸濃度達到10%時，所提蛋白質含量最多，隨后蛋白質含量逐漸降低（圖3）。三氯乙酸通過改變pH值而使蜂蜜蛋白變性，聚集沉淀，10%的三氯乙酸恰好可以使蜂蜜蛋白完全沉淀，濃度過大，會沉淀不同分子量的蛋白質，使得沉淀蛋白變少[16]。因此將10%的TCA濃度作為響應面法優化TCA濃度的中心點。

料液比對蜂蜜蛋白提取的影響見圖4。

圖4 料液比對蜂蜜蛋白提取的影響Fig.4 Effect of feed-liquid ratio on extraction of honey protein

隨著溶劑增多，所提蛋白質含量逐漸增加，在料液比達到1∶2（g/mL）時，所提蛋白質含量最多，隨后所提蛋白質含量逐漸降低（圖4）。這可能是因為溶劑增多會使蛋白質充分溶解沉淀，但溶劑過大，提取溶劑量的增加會使蜂蜜蛋白濃度降低，聚集沉淀困難[20]。結果表明，料液比對于蜂蜜蛋白沉淀影響較大，且1∶2（g/mL）時所提蛋白最多，損耗蜂蜜較少，因此，選取1∶2（g/mL）作為響應面法優化料液比的中心點。

2.3 響應面試驗結果

綜合單因素試驗結果，以蛋白質含量Y為響應值，料液比（A）、TCA 濃度（B）、提取時間（C）這 3個因素進行響應面試驗，所得結果見表2。

表2 蜂蜜蛋白提取響應面試驗結果Table 2 Response surface test results of honey protein extraction

由表2可以看出，蜂蜜蛋白的含量范圍在56.31 μg/g～101.88 μg/g，料液比 1 ∶2（g/mL），TCA 濃度10%，提取20 min所得蜂蜜蛋白最多。利用Design-Expert 8.0.5b數據處理軟件對表2所列蜂蜜蛋白提取響應面試驗結果進行二次響應面回歸分析，所得擬合方程為：Y=98.73-4.10A-4.16B+3.26C-6.83AB-0.20AC-0.045BC-18.42A2-8.10B2-4.51C2。

方差分析及可信度分析見表3。

表3 回歸模型方差及可信度分析Table 3 Analysis of variance and reliability of regression model

從表3中可分析建立的蜂蜜蛋白提取回歸模型的可信度。從該回歸方程的失擬項（P=0.687 4＞0.05），P 值（P＜0.000 1）、F 值（47.54）、擬合系數（98.39%）、變異系數（2.86）、信噪比（22.570）可以看出，該方程的擬合度較好，模型顯著且該模型響應信號強，因此由響應面建立的回歸方程模型可以用來優化蜂蜜蛋白的提取[21]。所得模型的顯著性檢驗結果經方差分析顯示，A（料液比）、B（TCA濃度）、C（提取時間）和 AB、A2、B2、C2對蜂蜜蛋白的提取均有極顯著的影響（P＜0.01）。A（料液比）、B（TCA濃度）、C（提取時間）的F值分別為23.31、23.97、14.69，由此得出3個因素對蜂蜜蛋白提取的影響主次順序：B（TCA 濃度）＞A（料液比）＞C（提取時間）。

2.4 響應面交互作用試驗結果

料液比和提取時間對蜂蜜蛋白提取的交互作用，見圖5，料液比和提取時間對蜂蜜蛋白提取的交互作用見圖6，三氯乙酸濃度和提取時間對蜂蜜蛋白提取的交互作用見圖7。

從響應面的三維效應圖和等高線圖中可以看出料液比、TCA濃度以及提取時間的交互作用對蜂蜜蛋白提取的影響。三維效應圖中影響因素所對應的曲線坡度越大，等高線越密集，且呈現橢圓狀，則表明該因素值的改變對蜂蜜蛋白含量的影響越大[22]。從圖5、圖6、圖7的三維效應圖和等高線圖中可以看出，曲面存在最高點，即等高線的圓心處，為條件最大值；A（料液比）與B（TCA濃度）交互對蜂蜜蛋白提取影響作用明顯，C（提取時間）和B（TCA濃度）交互作用所成等高線圖呈近圓形，對蜂蜜蛋白提取影響不顯著。

圖5 料液比和三氯乙酸濃度對蜂蜜蛋白提取的交互作用Fig.5 Interaction of solid-liquid ratio and TCA concentration on honey protein extraction

圖6 料液比和提取時間對蜂蜜蛋白提取的交互作用Fig.6 Interaction of solid-liquid ratio and extraction time on honey protein extraction

圖7 三氯乙酸濃度和提取時間對蜂蜜蛋白提取的交互作用Fig.7 Interaction of trichloroacetic acid concentration and extraction time on honey protein extraction

圖5等高線圖顯示出TCA濃度的變化趨勢高于料液比，且三維效應圖中也顯示出TCA濃度所對應的曲線坡度較料液比陡，說明TCA濃度對蜂蜜蛋白含量的影響比料液比大。圖6顯示，料液比所對應的曲線與提取時間相比，坡度更陡，所以料液比對蜂蜜蛋白含量的影響大于提取時間，其等高線圖也近似圓形，說明料液比和提取時間交互作用對蜂蜜蛋白提取影響不明顯。圖7等高線為近圓形，表明三氯乙酸濃度和提取時間交互作用不明顯，這與表3回歸方差分析結果一致。

通過響應面優化得出蜂蜜蛋白的最優提取條件為：TCA 濃度 17.7%，料液比 1∶1.83（g/mL），提取時間37.2 min，蜂蜜蛋白含量最大，理論值為99.94 μg/g。

2.5 驗證試驗

在上述回歸模型所得優化條件下[TCA濃度17.7%，料液比 1 ∶1.83（g/mL），提取時間 37.2 min）]，進行蜂蜜蛋白提取的驗證試驗，進行3次平行試驗，見表4。

表4 蜂蜜蛋白提取試驗驗證結果Table 4 Verification results of honey protein extraction test

由表4可知，蜂蜜蛋白提取量平均值為100.50μg/g，RSD為0.82%，誤差較小，說明預測值和真實值擬合性較好，建立的回歸方程有良好的預測性。

3 結論

蜂蜜具有抗衰老、美容養顏等功能而廣受消費者的喜愛，但目前市場上蜂蜜品質參差不齊，蜂蜜蛋白類物質是近幾年發展起來的鑒別蜂蜜真偽的有效目標物，且蜂蜜中含有的酶和蜂王漿主要蛋白（major roy aljelly proteins，MRJPs）更是蜂蜜發揮活性的重要物質[23]。然而，蜂蜜糖含量高，其與蛋白質形成的復合物直接影響蜂蜜蛋白的提取，蛋白質的含量直接關系著后續蜂蜜蛋白質研究[24]，因此本文對椴樹蜂蜜蛋白提取方法進行了優化。

對比三氯乙酸沉淀、硫酸銨沉淀、乙醇沉淀3種蜂蜜蛋白提取方法可得，三氯乙酸沉淀法所得蜂蜜蛋白含量最高，為75.12 μg/g。單因素試驗結果表明，隨著料液比的增大、提取時間的增大、TCA濃度的增大，蛋白含量均表現為先增大后減小，料液比1∶2（g/mL）、提取時間20 min、TCA濃度10%時，蛋白的含量最大。通過分析響應面試驗結果，A、B、C這3個因素對蜂蜜蛋白提取均有一定的影響，其中B（TCA濃度）影響最大，A（料液比）和C（提取時間）次之，觀察所得三維效應圖和等高線圖發現，料液比和TCA濃度（AB）的交互作用對蜂蜜蛋白的提取有顯著的影響。響應面回歸模型得出的蜂蜜蛋白提取的最優條件為TCA濃度17.7%，料液比 1 ∶1.83（g/mL），提取時間 37.2 min 時，在此條件下，蜂蜜蛋白含量可達99.94 μg/g。通過3次平行試驗驗證優化結果，得出了蛋白含量為100.50 μg/g，略高于預測結果，經驗證該方法穩定可行，為椴樹蜂蜜蛋白的研究提供了科學依據。