核磁共振技術在大豆科學研究中的應用

程健博 李朋 孫悅 高帥 張根生

哈爾濱商業大學，黑龍江省普通高等學校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076

核磁共振技術在大豆科學研究中的應用

程健博 李朋 孫悅 高帥 張根生

哈爾濱商業大學，黑龍江省普通高等學校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076

核磁共振技術在大豆科學研究中的應用具有重要影響，本文從核磁共振技術在大豆蛋白研究中的應用，在大豆特定成分檢測中的應用及在大豆油脂品質控制中的應用三個方面闡述了核磁共振技術對大豆科學相關研究的影響，并對核磁共振技術在大豆科學研究的探索方向進行了展望，為該技術的進一步推廣應用提供借鑒和參考。

核磁共振技術; 大豆；應用

近年來，核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）技術在食品領域中的應用日益成熟，且在大豆科學研究中的應用也越來越得到重視。核磁共振波譜最早于二十世紀中葉由哈佛大學的伯塞爾((E.M.Purcell)和斯坦福大學的布洛赫(F.Bloch)等人用實驗所證實。與質譜、紅外光譜、紫外光譜共同稱為有機分析四大譜的NMR波譜，在我國已有幾十年的發展歷史，由于其廣泛的應用范圍和嚴密的理論基礎，并憑借快速、無損及操作簡便的應用特點，已經成為一種不可多得的重要分析手段。

目前核磁共振技術在大豆科學研究中的應用主要集中在低場核磁共振（L-NMR）、氫譜高頻核磁共振（1H-NMR）、碳譜高頻核磁共振（13C-NMR）及磷譜高頻核磁共振（31P-NMR）四個方面。在大豆蛋白質結構測定、特定成分定性檢測和油脂品質控制等領域的應用均有明顯的優勢，但NMR技術在定量測定目標成分時，在準確性方面還存在偏差，綜合評價體系還沒有建立。本文主要介紹的是NMR技術在大豆科學研究中的應用進展。

1 NMR技術在大豆蛋白研究中的應用

1．1 大豆蛋白結構的表征

NMR測定蛋白質結構的表征方法主要包括四大基本要素：（1）結構測定的主要NMR參數NOE （nuclear overhauser effect）距離測定；（2）核磁譜峰序列專一性歸屬；（3）NMR結構計算及結構評價；（4）數據收集的多維NMR技術。華菁對聚2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸與大豆分離蛋白接枝進行了探究，將大豆分離蛋白分散在8mo1/L尿素水溶液中，在氮氣保護下，以過硫酸銨為引發劑，合成了大豆分離蛋白接枝聚2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸共聚物（SPI-g-PAMPS），對以大豆分離蛋白為基質的層層組裝進行了探討。用13C固態核磁共振儀（13C -NMR）對SPI-g-PAMPS進行了表征，在δ=42、δ=53、δ=178處均有與SPI-g-PAMPS相吻合的吸收峰，證明了聚2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸己成功接枝到了大豆分離蛋白上。傅立葉紅外光譜儀（FTIR）及電鏡表征均證實聚2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸己成功接枝到了大豆分離蛋白上。Makoto Shimoyamada等在1H-NMR譜中，大豆α-乳清蛋白/皂素胰蛋白酶水解過程和α-乳清蛋白的結構變化進行表征。在探究大豆LEAI蛋白在不同環境中，保守基序Em-2M和Em-C多肽的結構及聚集行為時，薛蓉等選用TSP-d4作為內標，通過核磁共振波譜(NMR)法證實Em-C的螺旋和折疊結構特征及聚集行為可能在全長蛋白的功能中起到重要作用。

1．2 大豆蛋白特性的測定

在大豆科學領域，蛋白特性測定的準確性尤為重要。劉俊梅等在探究高剪切分散乳化技術促進凝膠持水性時，采用L-NMR技術從水分分布、水分遷移、持水能力三個方面研究高剪切分散乳化技術對大豆分離蛋白凝膠體系中水分狀態影響機制。試驗發現，橫向弛豫時間T21、T22、T23與剪切力表現為極顯著負相關，高剪切分散乳化技術能夠提高TG酶誘導的大豆蛋白凝膠持水能力，在貯存過程中，高剪切分散乳化技術能顯著提高凝膠持水性。Emmanuel Lepinel 等13C-NMR技術探究生物大豆粉中制備糠醛合成膠粘劑時，糠醛的反應與氫氧化鈣用量相關，亞甲橋的建立通過康尼查羅反應完成。但是，并沒有證明制備糠醛過程有共價離子的參與。相似研究還出現在孫超的文章中，大豆分離蛋白及其接枝產物兩張譜圖在化學位移δ=54和δ=173處都存在吸收峰，其應分別歸屬于大豆分離蛋白分子中的氨基酸上的叔碳和羰基碳的吸收峰，這與于德泉、楊峻山報道的化學位移吻合。而在接枝產物的譜圖中新出現了四個吸收峰，化學位移分別δ=55、δ=16、δ=6和δ=184，它們分別歸屬于聚甲基丙烯酸接枝鏈上的仲碳、伯碳、季碳和梭基上的碳，這與謝緬諾維奇.赫拉莫娃[20]報道的c、d、e、f各自的化學位移值分別為δ=54、δ=17、δ=45和δ=179，也是吻合的。由此進一步證明了大豆分離蛋白接枝甲基丙烯酸的成功。

1．3 擠壓大豆蛋白水分的表征

陳鋒亮等在研究大豆蛋白擠壓組織化過程中水分的變化時，選擇L-NMR法中的CPMG脈沖序列測定，用橫向弛豫時間T2進行表征。由于擠壓組織大豆蛋白中水分含量較低，研究者將采樣點數（TD=21150）、采樣頻率（SW=250.00kHz）、間隔時間（TR=600ms）、回波個數（Echo Count=350）、累加次數（NS=32）均設置為較高值以增加測試準確性。Ruan R. S等研究發現，水分子的流動性與馳豫時間的長短成正比例關系。弛豫時間越短，水分與底物結合越緊密，弛豫時間越長，水分越自由。因此，根據弛豫時間的長短，可以得知水分與物料的結合程度。差示量熱掃描（DSC）和L-NMR兩種方法分析擠壓組織化產品中水分形態結果的相關分析，可以看出，DSC測得的凍結水、非凍結水分別與L-NMR法測得的自旋-自旋弛豫時間T22和T21之間存在顯著的相關關系，相關系數分別為0.96（p＜0.01）和0.54（p＜0.05），這表明盡管DSC和L-NMR這兩種技術的測定原理截然不同，但兩種方法測定水分狀態的結果是相同的，但低場核磁脈沖在測定速度、成像等方面具有明顯優勢。

2 NMR技術在大豆特定成分檢測中的應用

2．1 大豆卵磷脂含量的測定

核磁共振波譜可用來作定量分析，其定量分析的基礎是各化學環境不同的核、吸收峰出現的位置不同，可得到不同化學位移信號。施邑屏等采用了核磁共振法（31P-NMR）對針劑大豆卵磷脂的組份進行了定性及定量分析。與定磷法等經典磷脂分析方法相比，31P-NMR法分析磷脂化合物具有快速、靈敏、干擾因素較小，準確度較高的優點。不足之處是樣品需要量較大，在90兆核磁共振儀中，一般需要30～60mg。類似的研究還出現在對磷脂酶A1催化水解大豆卵磷脂后的樣品中，卵磷脂、溶血磷脂、甘油磷脂酰膽堿的相對含量的測定試驗中。杜章斌等利用1H-NMR，分別選取化學位移δ=3.76～ 3.83、δ=4.14～4.16、δ=4.40～4. 50處的信號峰作為卵磷脂、溶血磷脂和甘油磷脂酰膽堿的特征性質子峰，并根據質子峰相對面積與物質的量的對應關系確定三者的含量。結果表明，卵磷脂、溶血磷脂、甘油磷脂酰膽堿的加標回收率分別為101.6%～107.0%、79.8%～92.4% 、102. 0%～107.1%，相對標準偏差分別為1.6%～2.5%、3. 6%～6.5%、5.6%～6.7%。精密度試驗中卵磷脂、溶血磷脂、甘油磷脂酰膽堿的相對標準偏差分別為4.2% 、3.5% 、2.3%；對磷脂酶A1催化水解大豆卵磷脂4h與8h的兩個樣品進行檢測，結果表明樣品中卵磷脂、溶血磷脂、甘油磷脂酰膽堿的相對含量分別為71.2% 、22.1 %、6.7%、22.4%、0、77.6%。

鄭衛琴等采用1H-NMR和31P-NMR兩個圖譜結合起來分析高純大豆卵磷脂HLB值的方法，通過建立求算HLB值得方程式HLB=21.4R，可快速有效測定出非離子表面活性劑大豆卵磷脂不同PC純度的HLB值，這對產業化制備高純度卵磷脂有實質性意義，比HPLC法分析更快速，但在準確度上與HPLC法稍有差距。楊麗華等用31P-NMR法對磷脂中磷含量及卵磷脂含量進行測定。即用31P-NMR譜測定總磷含量，并以已知含磷量的三苯基膦為樣品，驗證該方法的可行性，誤差在±5%。用31H-NMR譜測定了磷脂中卵磷脂含量，該方法簡單便捷，結果反應迅速，可用于對大豆磷脂含量的快速檢測。

2．2 大豆中油脂含量的測定

利用NMR技術快速無損測定成分含量，是一項國際前沿技術。馬愛萍等利用索氏提取法、NMR法和NIRS法對大豆種子脂肪含量進行測量比較，結果表明NMR法測定的結果與索式提取法更接近，偏差均小于95%，最低偏差僅為2%，而NIRS法與索式提取法有較大偏差。宋丹陽等用NMR法建立大豆含油量核磁共振法測定標準曲線，并進行了大量樣品數據分析（大豆含油量的分析）。NMR法測定與國家標準索氏抽提法測定結果的標準曲線為y=09632x+07937，相關系數為0 98%，與索氏抽提法相比，具有簡便快速、安全、不損傷種子且不需烘干樣品等優點。在大豆品種改良、收購及加工利用和進出口貿易等領域具有廣闊的應用前景。

3 NMR技術在大豆油脂品質控制中的應用

3．1 大豆油品質的測定

煎炸食品的質量與煎炸油的品質關系巨大，油脂的酸價、碘價、極性組分含量、煙點、過氧化值、羰基價等指標都是反映其質量的重要指標。低頻核磁共振（L-NMR）技術作為一種快速、準確、無損的檢測方法，可廣泛用于油品質的監測過程。張瑜等[30]通過核磁共振弛豫時間T2w與煎炸時間、酸價、撥基價、極性組分含量的相關性發現，兩者呈負相關性，相關系數在0.9058～0.994之間。Justyna Sadowska等同樣對大豆油的氧化影響進行了研究。經1H-NMR及13 C-NMR分析，氧化時間影響大豆油酸價，粘度和摩爾質量。王永巍等同樣應用L-NMR技術對煎炸大豆油油樣進行檢測，通過對T2、T2w及S21分析，煎炸4h后圖譜中10ms左右出現特征峰，峰值較小，且S21和T2w與煎炸時間、酸價、粘度、吸光度和極性組分含量呈明顯的規律性，相關系數在0.941 ～0.997之間。 分析煎炸過程中，氧化、聚合、水解等反應可能產生了不同于甘油三酷的物質，導致理化指標改變，進而引起油脂內部磁場的改變，氫質子從磁場的激發態到平靜狀態的恢復時間發生了變化。

Maritana Fariasa等在基于氧化鉬（VI）絡合物運用均相催化系統研究大豆油環氧化問題時，在800℃條件下，反應產物反應8小時后，形成單環氧化物的產品可以從1H-NMR譜中，2.9 ppm處出現有關形成環氧基團中的氫信號得到驗證。張鐘華等基于核磁共振原理，研制的一種大豆含油量快速測定儀，與傳統檢測大豆含油量過程復雜、耗時長、準確性不夠高的萃取方法相比，該設備可快速得到大豆含油量讀數。且測量范圍為10%～25%，讀數精確度大于99%。以上研究說明L-NMR技術可有效地反映大豆煎炸油品質的改變。楊揚等利用1H-NMR，13C-NMR光譜（核磁共振氫譜、碳譜）檢測了大豆油及地溝油進行檢測。結果發現，地溝油在氫譜圖的δ5.50、δ5.10和δ3.73等處有明顯的雜峰；地溝油在氫譜圖的δ1.26處的峰比δ1.30處明顯強很多；地溝油碳譜圖在δ178.33，δ173.87，δ86.60，δ68. 39和δ65. 06處有明顯的小峰存在，這是由于其產生酸敗和處理過程中有部分甘油酯的分子發生變化造成的。所以該方法可以作為判斷地溝油的依據。

3．2 大豆生物柴油品質的測定

Isac G. Rosset等在用南極洲念珠菌固定化脂肪酶催化酶解大豆油時，利用1H-NMR技術和氣相色譜對生成生物柴油過程進行定量分析。在1H-NMR譜中，明顯發現南極念珠菌B型固定化脂肪酶催化大豆油的條件更溫且得率高。1H-NMR技術和氣相色譜均可對其進行表征，但1H-NMR技術更加簡便。M.R. Monteiro等使用1H-NMR定量描述大豆油制備生物柴油過程，采用核磁共振和積分運算分析油脂結構并繪制標準曲線。結果表明，1H-NMR法可以不受任何生物柴油或柴油類型的影響，因此，這種技術是特別有價值的測定方法。

4 結語

自從二十世紀中葉以來，就有關于NMR技術在大豆科學研究中應用的報道出現，但大多數是研究NMR技術的表層機理。建立NMR技術在大豆蛋研究，大豆特定成分檢測及在大豆油脂品質控制等領域的綜合評價體系，是未來探索的重要方向之一。這類體系的建立，不僅可以更廣泛的準確定量檢測目標成分，同時也可以更加快速便捷的獲得試驗結果，這將對 NMR技術在大豆科學研究中的應用有極為重要的意義。

[1]高明珠．核磁共振技術及其應用進展[J]．信息記錄材料,2011(03): 48-51．

[2]黃友如,裘愛泳,華欲飛．核磁共振技術在大豆蛋白研究中應用[J]．糧食與油脂,2004(02): 19-21．

哈爾濱商業大學創業訓練項目 201510240162

程健博(1991—)，男，碩士，研究方向為食品科學．

?通訊作者：張根生(1964—)，男，教授，碩士，研究方向為畜產品加工。