植物冷激蛋白的研究概況

楊雪 張東哲 吳疆

摘 要：在植物體內合成的特定低溫應激蛋白中，多數已經被鑒定。近年來，研究的焦點主要集中在幾種特殊類型的冷激蛋白，其中，植物抗凍蛋白保護細胞免受冰晶破壞，分子伴侶和脫水蛋白在冷脅迫期間保護細胞大分子不受損傷，線粒體內解偶聯蛋白的氧化和磷酸化過程，可以使植物保持高于0℃一段時間，為隨后適應低于0℃的環境做充分的準備。

關鍵詞：植物；冷激蛋白；應激蛋白

中圖分類號 Q946 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）22-0017-03

Abstract：In the plant，specific low temperature stress protein synthesized by the plant most have been identified. In recent years，the focus of the research is mainly concentrated in some special types of cold shock protein，such as the plant antifreeze proteins to protect cells from ice crystals，molecular chaperone and dehydration proteins to protect cell macromolecular damaged during cold stress，mitochondrial uncoupling protein oxidation and phosphorylation in process，will keep plants above 0℃ for a period of time，in order to adapt then below 0℃ environment.

Key words：Plant；Cold shock protein；Stress protein

植物適應低溫的過程，是一個多種生化機制共同作用的結果，其中許多機制已經進行了深入的研究。這些機制包括脂質和磷脂的代謝，不飽和脂肪酸[1]和的糖積累。這些代謝過程阻止植物細胞內的冰致死[2]。

所有這些機制都擁有一個共同的特點，就是有多種多樣酶蛋白的參與。這些酶包括磷脂酶和脫氫酶參與的脂質代謝[3-4]，蔗糖合成酶參與的細胞內蔗糖的生物合成。植物冷適應特性正式通過改變這些酶的生物合成和活性來實現的，最終，都涉及到這些酶基因表達調控的改變[5-6]。低溫脅迫在抑制植物持家基因表達的同時誘導應激蛋白的生物合成[7]。大量的研究表明，冷激蛋白不僅參與了植物細胞防御機制的形成，在植物耐受寒冷脅迫過程中也具有重要作用。

1 抗凍蛋白

植物在低溫下，特別是在低于0℃的溫度下合成的蛋白質具有一個特殊的功能，就是防止細胞內冰晶的形成。雖然低溫下植物細胞內阻止冰核生長主要是由于糖類的積累[8]，但在低溫脅迫期間合成的特異性蛋白也影響了冰核和冰晶的生長。例如，冬黑麥的葉片合成的一種分泌到液泡和細胞間質中的蛋白質，就改變了冰晶生長的類型，并降低了細胞質的冰點溫度[9]。冬黑麥能夠具有這樣的耐凍性，主要是由于合成了許多分子量在15～109kD的蛋白。免疫學分析表明這些蛋白質的定位于葉肉細胞的外細胞壁的表面，木質部導管的次生細胞壁，并在表皮細胞的細胞壁。由于黑麥抗凍蛋白定位在可能的細胞接觸位點，其功能是作為一個屏障，防止冰凍影響細胞和抑制結晶的生長。研究發現，冬小麥中第五號染色體控制了抗凍蛋白的生物合成和其抗寒性的提高[10]，通過SDS-電泳和免疫印跡確定了兩個抗凍蛋白，分子量分別為32kD和35kD，它們位于葉肉細胞的細胞壁和木質部導管中。在進過冷適應的葉片中，這些蛋白質定位在粗面內質網，高爾基體，質膜的囊泡[11]。這些研究結果表明抗凍蛋白是通過胞外分泌途徑被定位在合適位點的。在植物體內同樣也能夠發現分子量是25、32和35kD的蛋白，但這些蛋白的與抗凍蛋白的定位是完全不同的，同時這些蛋白質對植物耐受低溫脅迫也不起任何作用。

2 分子伴侶與脫水蛋白

植物在低溫脅迫期間合成的蛋白質具有另一個重要功能，就是對由細胞脫水誘導損傷大分子的保護。最初，分子伴侶的作用被認為是幫助其它蛋白質形成正確的空間立體結構[12]。后來，分子量是60、70和90kD的分子伴侶被發現是熱激蛋白[13]，另一些分子伴侶為冷激蛋白。

大腸桿菌內的一個分子伴侶表現出丙基異構酶的活性，它與核糖體新生多肽相連接，結合形成CPN60（伴侶蛋白60）。與大多數伴侶不同，它是一個熱激蛋白，其生物合成受到一個觸發因子的影響，在溫度從42℃逐漸降低到16℃的過程中，它的表達量反而升高了。研究表明，這個觸發因子是一個冷激蛋白。這一研究結果表明，雖然熱激蛋白是在高溫下對細胞起保護作用，但是其生物合成受到冷激蛋白的觸發[14]。

在春小麥和冬小麥中，低溫馴化在相當大的程度上影響了脫水蛋白和胚胎發育晚期豐富蛋白質（LEA）的表達[15]。脫水蛋白的主要功能是穩定大分子結構，這一功能與蛋白伴侶的作用非常相似[13]。從9月至11月，冬小麥細胞內的脫水蛋白含量比春小麥中的顯著增高。經過這樣的冷適應過程，冬小麥細胞內積累了大量的脫水蛋白，并使得冬小麥表現出很強的耐寒性[16]。

冬小麥中的冷激蛋白（WCS120）是在冷適應的過程中得到積累的[17]。這些蛋白質是谷類作物特有的，通過低溫控制其在細胞內的含量。免疫學研究表明，50kD的WCS120至少涉及了5個WCS120家族[17]。同時，利用Western blotting研究WCS120蛋白質的含量和細胞內定位表明，這些WCS120家族都定位在細胞質和細胞核內，在其他的細胞器和細胞壁上沒有發現。這些研究結果表明，WCS120的主要具有兩個生物學功能，一個是保護細胞內的生物大分子，另一個是在細胞核內保護基因的轉錄過程。WCS120的高含量、高親水性以及其對熱的抗性，推測其在低溫環境中可以給細胞內的生物大分子提供一個特定的微環境使細胞能夠抵抗低溫脅迫和冰凍脅迫。

利用Western blotting和Southern blotting技術對中國春小麥著絲粒端wcs120基因進行雜交研究，表明該基因在所有受試小麥品種中定位于6號染色體的長臂端。這一結果表明，wcs120基因定位于6DL染色體，并使得6A染色體同源基因沉默[18]。

研究發現，在哺乳動物和細菌中，一些與DNA和RNA結合的CSP也是一種伴侶分子，特別是其中的CSPA注意作用于RNA[19]。并且，他們之間的結合不是序列特異性結合：CSPA與RNA序列中超過74個核苷酸長度的序列都會發生結合作用，從而阻止RNA在低溫下形成的二級結構。這一功能很有可能對mRNA在低溫下進行正常的翻譯起到了很好地保護作用。

許多細菌的CSP是RNA和DNA的調節蛋白，例如，大腸桿菌中的CSPA[20]，枯草芽孢桿菌中的CSPB、CSPC和CSPD，這些CSP都具有核苷酸結合結構域（冷休克域，CSD）。目前，已對RNA結合應激蛋白進行了大量研究，例如魚腥草中的RBPA1，大麥中的HAVGRP3。同時，越來越多的研究表明，與RNA結合的CSP不僅在轉錄水平，而且在轉錄后水平對基因的表達起了重要的調控作用[21]。

3 解偶聯蛋白（UCP）

冷激蛋白另一重要功能就是使機體對外界環境溫度變化產生防御能力，它可以在植物遇到低溫的第一時間提供短暫的熱量，以使植物可以有冷適應的準備時間。這一保護機制與線粒體氧化磷酸化的解偶聯機制密切相關，在哺乳動物中以發現3個解偶聯蛋白：UCP1，UCP2，UCP3[22]。同樣的在馬鈴薯、冬黑麥、番茄、玉米及各種植物的果實中也發現了這3個蛋白。將氧化磷酸化過程與電子在呼吸鏈的傳遞過程解偶聯，可以釋放出一定的熱量，植物就可利用這些熱量對機體進行溫度調節。冬小麥在遇到霜凍時，正是通過將氧化磷酸化過程與電子在呼吸鏈的傳遞過程解偶聯，從而產生了熱量，使冬小麥幼苗可以經歷寒冬。研究表明，在冬小麥中這一耐受低溫機制是由分子量為310KD的CSP控制的，在低溫環境中，CSP310作為誘導解偶聯的調控因子發揮功能[20]。

目前，在人、哺乳動物和植物的線粒體中都已發現有解偶聯蛋白，這些蛋白的主要作用都是將線粒體中的氧化磷酸化解偶聯。所有已知的UCP均屬于線粒體內蛋白家族，且是定位于線粒體內膜的膜蛋白[21]。人類及哺乳動物線粒體內含有UCP1、UCP2和UCP3，而植物線粒體內含有PUMP、StUCP和CSP310。

UCP1，早前被稱為UCP或產熱素，是一個典型的線粒體UCP蛋白，其定位于于哺乳動物的褐色脂肪組織。這個33kD的蛋白質是由核基因組編碼的，由360個氨基酸組成的單體蛋白，發揮功能的時候形成了蛋白質二聚體[22]。哺乳動物棕色脂肪組織是已知的專門產生附加熱量的組織。線粒體內膜包含有大量的UCP1，從而使脂肪組織呈現棕色。UCP1的主要作用是橫跨線粒體內膜，作為質子進出線粒體的載體，在這一質子進出線粒體的過程中，嘌呤核苷酸起阻礙的作用，而脂肪酸起加速的作用[20-21]。激活的UCP1是質子返回線粒體基質空間的媒介，其結果是氧化磷酸化解偶聯，代謝產生的能量以熱的形式散放出來。

目前有兩種模型解釋脂肪酸對UCP1的刺激作用。第一種模式認為UCP1是質子載體，脂肪酸是其變構調節劑；第二種模式認為UCP1是一種能夠促進脂肪酸陰離子跨膜易位的化合物[22]。通過UCP1的作用，脂肪酸發揮了其解偶聯的功能，脂肪酸陰離子保留在膜和水相之間的界面處，羧基朝向的水相，親脂的“尾巴”朝向膜的內側疏水區域。這也很好地解釋了為什么脂肪酸陰離子很難穿過膜，而其中性和陽性離子卻能夠很容易穿越生物膜[22]。

冷激蛋白與這些典型的解偶聯蛋白具有一些顯著的差異。典型的解偶聯蛋白往往是結合在線粒體內膜上，而冷激蛋白通常是一種細胞質蛋白。雖然冷激蛋白的解偶聯活性機制尚未明確，但很明顯，它與其他膜結合型解偶聯蛋白的機制是完全不同的。CSP310最初是從冬黑麥幼苗中分離的一個胞質蛋白，它的解偶聯作用機制目前仍然不確定，但是明顯與UCP的解偶聯機制是不相同的。

綜上所述，在植物體內存在3種類型的冷應激蛋白：冷激蛋白，保護細胞免受冰晶損壞；蛋白伴侶和脫水蛋白，防止生物大分子在冷適應過程中變性失活；解偶聯蛋白，使植物可以在冰點以下維持生長一段時間，為冷適應過程爭取時間。

參考文獻

[1]De la Roche，Andrews CJ，Pomeroy MK，Weinberger P，et al. Lipid Changes in Winter Wheat Seedlings（T.aestivum）at Temperatures Inducing Cold Hardiness[J].Can J Bot，1972，50（12）：2401-2409.

[2]Los DA，Ray MK. Differences in the Control of the Temperature-Dependent Expression the Four Genes for Desaturases in Synechocystis sp.PCC.6803[J].Mol Microbiol，1997，25（11）：1167-1175.

[3]Sakamoto T，Bryant DA. Temperature-regulated mRNA Accumulation and Stabilization for Fatty Acid Desaturase Genes in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002[J]. Mol Microbiol，1997，23（6）：1281-1292.

[4]Crespi MD，Zabaleta EJ，Ponds HG，et al. Sucrose Synthase Expression during Cold Acclimation in Wheat[J].Plant Physiol. 1991，96（1）：887-891.

[5]Guy ChL，Huber JLA，Huber SC. Sucrose phosphate Synthase and Sucrose Accumulation at Low Temperature[J].Plant Physiol，1992，100（1）：502-508.

[6]Abromeit M，Askman P，Sarnighausen E. Accumulation of High-Molecular-Proteins in Response to Cold Hardening and Abscisic Acid Treatment in Two Winter Wheat Varieties with Different Frost Tolerance[J].J Plant Physiol，1992，140（1）：617-622.

[7]Griffith M，Ala P，Yang DSC. Antifreeze Protein Produced Endogenously in Winter Rye Leaves，Plant Physiol[J].1992，100（2）：593-596.

[8]Griffith M，Antikainen M，Hon WC.，et al. Antifreeze Proteins in Winter Rye[J]. Plant Physiol，1992，100（3）：327-332.

[9]Pihakaski-Maunsbach K，Griffith M，Antikainen M.Immune gold Localization of Gluconase-Like Antifreeze Protein in Cold Acclimated Winter Rye[J].Protoplasma，1996，191（2）：115-125.

[10]Gatenby AA，Viitanen PV.Structural and Functional Aspects of Chaperonin-mediated Protein Folding，Annu[J].Plant Mol Biol，1994，45（3）：469-491.

[11]Close TJ.Dehydrins：Emergence and a Biochemical Role of a Family of Plant Dehydration Proteins[J].Physiol Plant，1996，97（4）：795-803.

[12]Kandror O，Goldberg AL.Trigger Factor Is Induced upon Cold Shock and Enhances Viability of Escherichia coli at Low Temperatures[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（1）：4978-4981.

[13]Robertson AL，Weninget A，Wilen RW.Differential Expression of Dehydrins in Spring and Winter Cereals during Cold Acclimation[J].Plant Physiol，1994，105（1）：169-182.

[14]Robertson AJ，Weninger A.Comparison of Dehydrin Gene Expression and Freezing Tolerance in Bromus in，ermis and Secalecereale Grown in Controlled Environments，Hydroponics，and the Field[J].Plant Physioi，1994，106（1）：1213-1216.

[15]Houde M，Daniel C，Lachapelle，M.Immunolocalization of Freezing-Tolerance-associated Proteins . in the Cytoplasm and Nucleoplasm of Wheat Crown Tissues[J].Plant J，1995，8（4）：583-593.

[16]Sarhan F，Ouellet F，Vazquez-Tello A.The Wheat WCS 120 Gene Family：A Useful Model to Understand the Molecular Genetics of Freezing Tolerance in Cereals[J].Physiol Plant，1997，101（2）：439-445.

[17]Jiang WN，Hou Y，Inouye M.cspA，the Cold-Shock Protein of Escherichia coli，Is an Major Chaperone[J].J Biol Chem，1997，272（1）：196-202.

[18]Li WW，Hsiung YC，Wong V.Suppression of grp78 Core Promoter Element-mediated Stress Induction by the dbpA and bpB（YB-1）Cold Shock Domain Proteins[J].Mol Cell Biol. 1997，17（1）：61-68.

[19]Ladomery M.Multifunctional Proteins Suggest Connections between Transcriptional and Post-Transcriptional Processes，BioEssays[J].1997，19（10）：903-909.

[20]Jezek P，Engstova H，Zackova M，Vercesi AE，et al. Fatty Acid Cycling Mechanism and Mitochondrial Uncoupling Proteins[J].Biochim Biophys Aeta，1998，1365（1-2）：319-327.

[21]Voinikov V，Pobezhimova akina，Kolesnichenko A，et al. Stress Protein 310 KD Affects the Energetic Activity of Plant Mitochondria under Hypothermia[J].J Therm Biol. 1998，23（1）：1-4.

[22]Palou A，Pico C，Bonet ML. The Uncoupling Protein，Thermogenin[J].Int J Biochem Cell Biol，1998，30（1）：7-11.

（責編：張長青）