絨毛細胞核型分析在胚胎停育中的應用觀察*

成志湯素環譚衛荷佘芹陳玉鈴

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絨毛細胞核型分析在胚胎停育中的應用觀察*

成志①湯素環①譚衛荷①佘芹①陳玉鈴①

【摘要】目的：研究胚胎停育的原因并探討絨毛細胞核型分析在妊娠指導及胚胎停育中的應用價值。方法：選取2014年1月-2015年12月本院收治的胚胎停育患者手術清宮絨毛組織標本100例，作為研究對象。對所有無菌絨毛標本進行長期細胞培養、染色體制備與細胞核型分析，同時分析患者胚胎停育產生的原因，研究絨毛細胞核型在妊娠指導及胚胎停育中的應用價值。結果：100例胚胎停育絨毛組織標本經長期細胞培養成功95例，培養成功率達95.00%，培養成功標本中檢出異常核型34例，異常率為35.79%，異常核型分類中常染色體三體標本16例（47.06%），三倍體標本7例（20.59%），四倍體標本3例（8.82%），嵌合體標本3例（8.82%），性染色體單體標本3例（8.82%），結構異常2例（5.88%），其中常染色體三體異常檢出率明顯高于其他異常核型檢出率，差異有統計學意義（P＜0.05）；絨毛細胞核型正常標本61例中，男性核型25例（40.98%），女性核型36例（59.02%），性別核型構成比比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論：胚胎絨毛細胞核型異常是導致胚胎停育的主要原因之一，并且異常核型以常染色體三體最為常見，通過分析絨毛染色體核型有助于明確患者胚胎停育的原因，可對患者下次妊娠提供合理的指導，具有臨床應用及推廣價值。

【關鍵詞】絨毛細胞核型分析； 胚胎停育； 影響因素； 研究意義

①廣東省清遠市人民醫院 廣東 清遠 511518

First-author’s address：Guangzhou Medical University Sixth Affiliated Hospital Qingyuan People’s Hospital，Qingyuan 511518，China

胚胎停育是一種臨床上較為少見的妊娠惡性結局，隨著近年來環境的惡化以及生活飲食習慣的轉變，我國胚胎停育發生率呈遞增趨勢［1］。病理生理學分析認為胚胎停育是因多種因素如孕卵缺陷、母體不利于妊娠等復雜因素導致的一種妊娠早期胚胎死亡的病理性妊娠，雖然臨床上未完全明確導致胚胎停育的原因，但多數學者認為遺傳、免疫、激素、生殖感染、內分泌功能等因素是導致胚胎停育的主要原因，并且以遺傳因素最為常見，尤其是胚胎染色體異常已被廣泛認可作為胚胎停育的主要誘發因素［2］。正常生理與遺傳性角度中，絨毛細胞作為胚胎外胚層細胞，其具有與正常胚胎組織完全相同的生物遺傳形狀，因此通過采集胚胎停育患者絨毛細胞并進行染色體核型分析可獲取胚胎細胞的遺傳性狀，進而直接分析遺傳因素對胚胎停育的影響［3］。本組研究采用長期細胞培養法，通過對100例胚胎停育絨毛細胞標本進行細胞培養，分析培養成功絨毛核型進而研究絨毛細胞核型分析在妊娠指導及胚胎停育中的應用價值。現報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 選取2014年1月-2015年12月本院收治的胚胎停育患者手術清宮絨毛組織標本100例，作為研究對象。患者年齡19～41歲，平均（28.6±3.2）歲，孕周8～12周，平均（10.5±1.2）周，其中高齡妊娠13例，試管嬰兒2例，存在稽留史患者9例，雙胎妊娠4例。納入標準：所有患者對本組研究完全知情同意，已通過本院倫理道德委員會審核；均明確為稽留流產；超聲檢查明確胚胎停止發育，無原始血管波動，無胚芽［4］。排除標準：精神疾病患者；性疾病患者；家族遺傳史；免疫功能異常；凝血機制障礙［5］。

1.2研究方法 所有患者均因稽留流產手術清宮，術中無菌采集絨毛組織5～15 mg。采用長期絨毛細胞培養法培養100例絨毛細胞標本，采用改良組織培養法與消化培養法共同培養。（1）改良組織培養法：首先將絨毛組織取出后放置于無菌細胞培養皿中，采用注射器抽取5 mL生理鹽水沖洗絨毛并將絨毛粘連的血凝塊及其他雜志徹底清除，采用無菌眼科剪修剪絨毛支，以分芽多，末端粗鈍呈仙人掌狀或鹿角狀的絨毛為最佳，后采用無菌手術刀片切碎絨毛組織，切碎后組織塊大小以能被5 mL注射器吸取為宜，5 mL GIBC羊水培養液注入細胞培養皿中，采用巴斯德吸管吸取含有細小絨毛組織碎塊的培養液移入培養瓶中，每次培養2瓶，將處理后的絨毛組織培養瓶置5% CO2培養箱中靜置培養，培養7 d后觀察是否存在絨毛組織細胞在培養瓶的底部發生貼壁生長，當發現存在有梭形和圓形細胞時，可更換絨毛細胞培養瓶中的新鮮培養液繼續進行細胞培養。（2）消化培養法：將絨毛組織從試管中取出，置放于無菌培養皿中，用注射器抽取5 mL生理鹽水，洗滌絨毛，去除肉眼可見的血液凝塊和雜質，用無菌剪刀剪下絨毛枝，一般以分芽多，末端粗鈍呈仙人掌狀或鹿角狀的絨毛為最佳，用無菌剪刀把絨毛組織剪碎，加入生理鹽水5 mL，用巴斯德吸管吸取含有細小絨毛組織碎塊的生理鹽水放入15 mL無菌離心管中，1800轉離心10 min，吸去上清，加入1 mL膠原酶和1 mL胰酶，吹打60～80次，放入培養箱中消化10 min左右，取出加入1 mL小牛血清，吹打均勻，終止消化，1800轉離心10 min鐘，棄上清，加入10 mL GIBCO羊水培養液，接種于兩個細胞培養瓶中，置于5% CO2培養箱靜置培養7 d，觀察有梭形和圓形細胞時，換新鮮培養液繼續培養。（3）培養瓶內換液后見絨毛細胞上皮樣或成纖維樣細胞生長良好，出現的圓形細胞數量較多就可以收獲細胞。收獲細胞前需向培養瓶中加如秋水仙素3滴，并放置于培養箱中繼續培養2～3 h，取出培養瓶并把培養液倒入離心管中，在每個培養瓶中加入2 mL 37℃預溫EDTA-胰酶，置于37 ℃水浴箱中6～8 min，加入原保留的培養液終止消化，將離心管進行高速離心處理，抽取并移除離心管中上清液，向離心管匯總加入4 mL已預溫到37 ℃的低滲液，置于水浴箱中低滲處理10 min，加入1 mL 3∶1的甲醇與冰醋酸固定液預固定1次，離心后棄上清再固定兩次，在冰片上滴片，75 ℃烤片3 h，胰酶顯帶，Gimsa染色，鏡下觀察并計數20個分裂相，配對分析5個核型，發現嵌合則加大計數量至100個細胞。

1.3觀察指標 記錄培養成功標本數，并統計分析培養成功標本的絨毛細胞核型，根據是否異常進行分組，異常核型分析染色體異常類型，正常核型分析胚胎性別，采用統計學處理分析胚胎停育常見絨毛細胞異常核型及正常核型性別差異。

1.4統計學處理 采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料采用 X2檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1絨毛細胞長期培養結果 100例胚胎停育絨毛組織標本經長期細胞培養成功95例，培養成功率達95.00%，培養成功標本中檢出異常核型34例，異常率為35.79%，檢出正常核型61例，正常率為64.21%。

2.2絨毛細胞異常核型類型分析 對絨毛細胞異常核型檢出的34例標本進行染色體異常類型分析可知，常染色體三體異常檢出率為47.06%（16/34），明顯高于三倍體的20.59%（7/34）、四倍體8.82% （3/34）、嵌合體8.82%（3/34）、性染色體單體8.82% （3/34）及結構異常5.88%（2/34）等類型檢出率，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.3絨毛細胞正常核型性別分析 分析絨毛細胞正常核型檢出的61例性別構成情況可知，絨毛細胞正常核型女性核型構成比為59.02%（36/61），明顯高于男性核型的40.98%（25/61），差異有統計學意義（X2=3.169，P=0.032）。

3　討論

胚胎停育是一種妊娠早期胚胎死亡的病理性妊娠，常作為一種惡性的女性妊娠結局被臨床所重視［6］。目前臨床通過實驗研究認為導致胚胎停育的主要因素為遺傳因素、免疫因素、環境因素與內分泌因素，其中遺傳因素是導致胚胎停育的主要因素，有關調查結果顯示胚胎停育中50%～60%的患者因胎兒染色體異常所致，而有研究表明因遺傳因素導致的胚胎停育不僅影響本次妊娠結局，同時可對患者下次或以后的妊娠均產生不同程度的影響，因此明確胚胎停育的原因及有效的干預對指導下次合理妊娠具有重要意義［7］。

本組研究結果顯示，95例培養成功的絨毛細胞標本中有34例標本檢出絨毛細胞核型異常，檢出異常率達35.79%，同時對于核型異常類型的分析結果顯示，常染色體三體異常檢出率明顯高于三倍體、四倍體、嵌合體、性染色體單體、結構異常檢出率；而在核型正常的61例絨毛細胞標本中，女性核型標本構成比明顯高于男性核型，差異有統計學意義（P＜0.05）。本組研究結果表明絨毛細胞核型異常是導致胚胎停育的主要原因，并且異常核型中以常染色體三體異常最為常見，而在正常核型胚胎性別分析中女性胎兒較男性胎兒更易發生胚胎停育。

通過實驗回顧分析可知，絨毛組織是人類受精卵正常發育過程中的胎盤附屬物，其與正常胚胎具有高度相同的生物遺傳性，即絨毛組織的染色體結構與胎兒的染色體結構、生物遺傳特性等基本一致，并且絨毛組織具有較強的細胞分裂能力，通過手術采集絨毛細胞后可通過相應的體外培養手段獲取足夠的處于分裂中期的絨毛細胞，進而通過分析培養后的絨毛細胞進行胚胎遺傳學研究［8］。

在本組研究中采用的是長期絨毛細胞培養法，目前臨床上對于絨毛細胞染色體等遺傳學分析常用的細胞培養法有直接培養法與長期培養法，傳統的直接培養法具有方便、快捷、便宜、易操作的應用特點，對于培養條件及實驗室水平的要求并不高，適用于基層醫院推廣應用，但直接絨毛細胞培養法無法直接獲取中期絨毛細胞染色體分裂象，同時絨毛細胞培養成功率較低［9］。而長期細胞培養法是一種培養時間較長、培養過程較為復雜的絨毛細胞培養法，主要通過組織塊培養與消化培養法獲取中期絨毛細胞染色體分裂相，但長期絨毛細胞培養法對實驗室條件、儀器要求較為嚴格，培養條件苛刻，操作步驟較為復雜，培養周期較長且培養費用較為昂貴，但由于其可獲取中期絨毛細胞及較高的成功率而被臨床所重視［10-11］。目前國外常規產前診斷技術已經包括絨毛細胞染色體的長期培養，但在我國僅有部分儀器較為先進、實力較強的產前診斷中心才可進行絨毛細胞的長期培養將其作為常規的產前診斷技術，而一般的醫院對產婦進行產前檢查主要依賴于對絨毛細胞的直接分析或采用直接法進行培養［12］。

研究結果顯示，絨毛細胞染色體的長期培養及染色體性狀分析，對于胚胎停育標本絨毛細胞遺傳物質，即染色體核型的鑒別與診斷中具有較高的臨床應用價值。在本組研究中的100例胚胎停育絨毛細胞標本中，采用長期培養法成功培養95例，培養成功率達95.00%，表明采用長期培養法，包括改良組織塊培養法以及消化培養法，能夠建立一種培養結果更為穩定，培養成功率更高，操作更為簡便的絨毛組織細胞染色體檢查方法，能夠縮短長期培養法的培養周期，并且保障絨毛細胞中期分裂相的培養成功率，可為臨床診治提供可靠的實驗依據，以便對類似患者妊娠進行遺傳咨詢、產前診斷和及時適當處理［13］。而對于絨毛細胞異常核型構成分析結果顯示，絨毛細胞常染色體三體異常核型最為常見，通過實驗回顧分析認為，在正常遺傳物質染色體異常中，主要的表現形式為移位、倒置、斷裂等結構異常以及單倍體、三倍體及多倍體等數目的異常，而在胚胎停育中染色體數目異常是主要的絨毛細胞異常核型類型，其中又以常染色體三體異常最為常見，分析其原因認為正常胚胎在性細胞成熟的過程中，以及受精卵的早期卵裂過程中，由于多種遺傳因素導致胚胎染色體未發生正常的分離，進而導致染色體數目的異常，而染色體增多一條或增多兩條等等便可導致染色體三體、三倍體、四倍體等數目異常的發生［14-15］。而對于正常絨毛細胞核型胚胎停育標本中，性別比例的差異表明女性胚胎更易發生胚胎停育，這可能與性染色體的遺傳性狀有關，同時有學者認為，正常絨毛細胞核型表明胚胎遺傳性狀的正常，可初步排除遺傳因素對胚胎停育的影響，因此對于絨毛細胞核型正常的胚胎停育患者應積極查找其他因素，通過對患者進行多方面的檢查明確是否因內分泌、環境、免疫等方面的影響因素導致胚胎停育，進而在下次或以后的妊娠中避免這些影響因素［16］。

本組研究也直接表明，產前檢查中行絨毛細胞培養及遺傳學細胞核型分析對保證妊娠安全的重要作用，通過絨毛細胞培養及絨毛細胞核型分析可判斷胚胎染色體是否發生異常，對于發生異常的絨毛細胞核型，進一步分析其絨毛細胞核型異常類型，重點警惕絨毛細胞染色體數目異常，尤其是常染色體三體異常絨毛細胞，其胚胎停育發生率較高，應及時給予患者干預或終止妊娠，以免發生惡性妊娠結局并且對下一次妊娠需接受產前診斷明確胚胎是否存在染色體異常。對于已發生胚胎停育的患者，若檢出絨毛細胞異常核型應進行進一步的患者遺傳學分析，明確導致絨毛細胞核型即胚胎核型異常的原因，及時治療干預，避免再次妊娠時患者發生胚胎停育；正常絨毛細胞胚胎停育的患者則需通過免疫因素、內分泌因素、環境因素等進行多方面分析，明確導致胚胎停育的非遺傳影響因素，進而通過針對性干預措施降低再次妊娠的胚胎停育發生率［17-20］。

綜上所述，胚胎絨毛細胞核型異常是導致胚胎停育的主要原因之一，并且異常核型以常染色體三體最為常見，通過分析絨毛染色體核型有助于明確患者胚胎停育的原因，可對患者下次妊娠提供合理的指導，具有臨床應用及推廣價值。

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Application Observation of Hair Cells Karyotype Analysis in the Embryo Damage

CHENG Zhi，TANG Su-huan，TAN Wei-he，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（11）：129-132

【Abstract】Objective：To study the reasons of embryo damage and discuss the application value of hair cells karyotype in the embryo damage and pregnancy guidance.Method：From January 2014 to December 2015，100 cases of embryo damage patients’ curettage villi tissue samples，which admitted in our hospital were selected as the research objects.All sterile villi samples were given the long-term cell culture，chromosome preparation and karyotype analysis.The cause of patients with embryo damage was analyzed at the same time.The application value of hair cells karyotype analysis in the embryo damage and pregnancy guidance was analyzed.Result：A total of 100 cases of embryonic damage villi tissue samples by cell culture for a long time，95 cases of success，the success rate was 95.00%.Development successful specimens’ detected abnormal karyotype in 34 cases，the abnormal rate was 35.79%，in the abnormal karyotype classification，triplox specimens 16 cases （47.06%），triploid specimens 7 cases （20.59%），tetraploid specimens 3 cases （8.82%），chimeric specimens 3 cases （8.82%），sex chromosome single specimens 3 cases （8.82%），abnormal structure 2 cases （5.88%）.Abnormal autosomal triplox detection rate was much higher than other abnormal karyotype detection rate，the difference was significant statistically significant （P＜0.05）.For the 61 cases hair cells karyotype normal specimens，the male karyotype 25 cases （40.98%），female karyotype 36 cases （59.02%），sex karyotype composition had more significant differences，the difference was significant statistically significant （P＜0.05）.Conclusion：Embryo villus cell abnormal karyotype is one of the main cause of the embryonic damage，and abnormal karyotype autosomal triplox is the most common，through the analysis of hair cells karyotype will help to clear the reason of embryonic damage patients，which can provide reasonable guidance on the next pregnancy patients and has clinical application and popularization value.

【Key words】Hair cells karyotype analysis； Embryo damage； Influencing factors； Research significance

*基金項目：清遠市科技計劃項目（00161751320722022）

通信作者：成志

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.11.037

收稿日期：（2016-01-10） （本文編輯：蔡元元）