血清循環(huán)DNA微衛(wèi)星位點(diǎn)雜合性缺失對(duì)宮頸癌與卵巢癌診斷的應(yīng)用價(jià)值研究

朱麗英 劉鑫 袁靜 劉麗榮

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550004)

血清循環(huán)DNA微衛(wèi)星位點(diǎn)雜合性缺失對(duì)宮頸癌與卵巢癌診斷的應(yīng)用價(jià)值研究

朱麗英 劉鑫 袁靜 劉麗榮△

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550004)

目的 探討血清循環(huán)DNA微衛(wèi)星位點(diǎn)雜合性缺失(LOH)對(duì)宮頸癌與卵巢癌的診斷應(yīng)用價(jià)值。方法 選取6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，采用血液基因組DNA提取試劑盒抽提各組血清標(biāo)本循環(huán)DNA 、PCR、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及硝酸銀染色對(duì)63例宮頸癌和33例卵巢癌(病例組)、63例子宮肌瘤(良性對(duì)照組)、63名健康成年女性血清標(biāo)本(健康對(duì)照組)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 宮頸癌在D3S1038、D3S1300、D3S1228位點(diǎn)LOH頻率分別為53.4%、60.3%、57.1%；卵巢癌在D17S579、D17S855、D17S786、D3S1038位點(diǎn)的LOH頻率分別為：45.5%、42.4%、27.3%、51.3%；所有位點(diǎn)的病例組與健康對(duì)照組的LOH差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；宮頸癌D3S1228位點(diǎn)與良性對(duì)照組的LOH差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；卵巢癌D17S579與D17S855位點(diǎn)與良性對(duì)照組的LOH差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 宮頸癌D3S1228位點(diǎn)及卵巢癌D17S579、D17S855位點(diǎn)具有較高的LOH，為進(jìn)一步研究血清循環(huán)DNA作為宮頸癌與卵巢癌的遺傳學(xué)輔助診斷指標(biāo)提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

循環(huán)DNA； 宮頸癌； 卵巢癌； 雜合性缺失

許多腫瘤患者循環(huán)DNA(circulatingcell-DNA，c-DNA)與正常人相比有很大差異，尤其是循環(huán)DNA檢測(cè)避免了當(dāng)前分子診斷需要采集癌組織作為標(biāo)本來(lái)源的困難，是一種有潛力的腫瘤標(biāo)志物。研究[1]發(fā)現(xiàn)，一些腫瘤患者血清中c-DNA具有與腫瘤組織中DNA相一致的分子遺傳學(xué)改變，如雜合性缺失(loss of heterozygosity，LOH) 。因此，尋找并確定宮頸癌及卵巢癌基因的LOH高發(fā)位點(diǎn)，對(duì)其輔助診斷具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集自2013年7月至2015年2月在貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和貴州省腫瘤醫(yī)院經(jīng)臨床病理檢查確診為宮頸癌患者63例、卵巢癌患者33例、子宮肌瘤患者和健康成年女性各63例血清標(biāo)本，分別于-80 ℃保存。

1.1.2 主要試劑 血液基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生物有限公司；引物合成由上海生工生物工程公司合成；Mix Taq DNA聚合酶購(gòu)自大連TaKaRa公司；丙烯酰胺、N,N-甲叉雙丙烯酰胺購(gòu)自上海華美公司；乙二胺四乙酸(EDTA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 血清循環(huán)DNA的提取 取600 μL血清標(biāo)本，按DNA提取試劑盒的說(shuō)明操作。分別取子宮肌瘤患者血清標(biāo)本作為良性對(duì)照組，健康成年女性血清標(biāo)本作為從作健康對(duì)照組。

1.2.2 PCR 本研究所用微衛(wèi)星有D3S1038、D3S1300、D3S1228、D17S579、D17S855、D17S786，其PCR 產(chǎn)物大小( bp ) 分別為115 bp、49 bp、89 bp、96 bp、104 bp、135 bp。所有位點(diǎn)的標(biāo)志參數(shù)均查自Gene Bank。PCR反應(yīng)體系25 μL:含 Mix Taq聚合酶12.5 μL,各種引物5 μL、模版DNA 4.0 μL、無(wú)菌雙蒸水3.5 μL 。95℃預(yù)變性10 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s,共35個(gè)循環(huán)；72 ℃7 min，4℃保存。

1.2.3 電泳 取PCR產(chǎn)物5 μL，加4 μL Loading buffer充分混勻，室溫下8%變性聚丙烯酰胺凝膠溶液電泳，加樣后120 V穩(wěn)壓電泳約1 h。

1.2.4 銀染色 膠板浸入10% 乙醇45 min，0.2%AgNO3，35 min，3%Na2CO35 min，5%冰乙酸終止顯色。每一步反應(yīng)后都用雙蒸水清洗。

1.2.5 結(jié)果判定 LOH判定標(biāo)準(zhǔn)：參照文獻(xiàn)[2]的判定, 與健康對(duì)照組多肽性條帶相對(duì)照，基因條帶消失或密度減少50% 以上為L(zhǎng)O H。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

宮頸癌在病例組D3S1038、D3S1300、D3S1228位點(diǎn)的LOH發(fā)生率分別為53.4%、60.3%、57.1%；子宮肌瘤在良性對(duì)照組D3S1038、D3S1300、D3S1228位點(diǎn)的LOH發(fā)生率分別為38.1%、46.0%、34.9%；宮頸癌3個(gè)位點(diǎn)與健康對(duì)照組的LOH差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；子宮肌瘤D3S1300位點(diǎn)與健康對(duì)照組的LOH差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；宮頸癌D3S1228位點(diǎn)與良性對(duì)照組的LOH差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

卵巢癌在D17S579、D17S855、D17S786、D3S1038位點(diǎn)的LOH率分別為：45.5%、42.4%、27.3%、51.3%。子宮肌瘤在D17S579、D17S855、D17S786、D3S1038位點(diǎn)的LOH率分別為：22.2%、17.5%、12.7%、38.1%。卵巢癌4個(gè)位點(diǎn)的病例組與健康對(duì)照組的LOH差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；子宮肌瘤D17S579、D3S1038位點(diǎn)與健康對(duì)照組的LOH差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)卵巢癌D17S579和D17S855位點(diǎn)與良性對(duì)照組的LOH差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1、圖1。

表1 卵巢癌各位點(diǎn)發(fā)生LOH頻率[n(%)]

注：與健康對(duì)照組比較，*P<0.05，#P<0.05；與良性對(duì)照組比較，△P<0.05。

3 討 論

c-DNA是一種存在于動(dòng)、植物和人的體液中的無(wú)細(xì)胞狀態(tài)的胞外DNA。研究[3]表明，外周血c-DNA一部分以游離形式存在于血清中，體細(xì)胞抑癌基因的失活是導(dǎo)致癌變的一個(gè)主要因素，常表現(xiàn)為L(zhǎng)OH。染色體LOH是指腫瘤基因組中特定染色體上某種DNA多態(tài)標(biāo)記(如微衛(wèi)星標(biāo)記)的等位基因片段由正常組織基因組的兩種變成一種，即等位基因型由雜合子變成純合子。造成LOH的原因可能是多位點(diǎn)染色體事件(如缺失、有絲分裂重組及不分離)、基因轉(zhuǎn)變和點(diǎn)突變的結(jié)果，從而導(dǎo)致抑癌基因附近的側(cè)翼標(biāo)記丟失，結(jié)果抑癌基因附近區(qū)域與發(fā)生第一次突變的等位基因相連的序列，成為純合性或半合性。

D3S1300和D3S1228兩個(gè)位點(diǎn)均位于3p14基因內(nèi)部，D3S1038位點(diǎn)定位于3p25。對(duì)于染色體3p對(duì)宮頸癌早期診斷是否有預(yù)測(cè)作用，存在一定的爭(zhēng)議[4]。本研究的檢測(cè)結(jié)果表明，宮頸癌D3S1228位點(diǎn)LOH發(fā)生率明顯高于子宮肌瘤組(P<0.05)，因此，我們認(rèn)為3p區(qū)域LOH對(duì)宮頸癌的診斷有重要的預(yù)測(cè)作用。張國(guó)玲[5]等發(fā)現(xiàn)50例原發(fā)性上皮性良惡性卵巢腫瘤(40例癌組織10例非癌組織)3p25 處LOH頻率為40.0%。在本次研究中， D3S1038位點(diǎn)發(fā)生LOH的頻率為51.5%。

D17S579位點(diǎn)和D17S855位點(diǎn)位于17q21，均與BRCA1基因連鎖，其中D17S855位點(diǎn)位于BRCA1基因內(nèi)部，而D17S579位點(diǎn)位于BRCA1基因的外側(cè)。D17S786與p53基因連鎖。劉爭(zhēng)等[6]發(fā)現(xiàn)在乳腺型導(dǎo)管增生組中，D17S855、D17S579位點(diǎn)LOH頻率分別為10%、16.7%，在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中LOH頻率均>25%。本研究結(jié)果顯示，卵巢癌在D17S579、D17S855位點(diǎn)LOH發(fā)生率明顯高于子宮肌瘤組(P<0.05)，因此，我們推測(cè)BRCA1基因相關(guān)的D17S855位點(diǎn)、D17S579位點(diǎn)的LOH對(duì)卵巢癌的診斷有重要的預(yù)測(cè)作用。劉銘等[7]采用PCR熒光測(cè)序儀凝膠電泳檢測(cè)34例食管癌患者手術(shù)切除的鱗狀細(xì)胞癌組織在D17S786等16個(gè)MS位點(diǎn)的LOH狀況，鱗狀細(xì)胞癌在D17S786位點(diǎn)LOH頻率為69.5%。本研究的檢測(cè)結(jié)果表明，卵巢癌D17S786位點(diǎn)發(fā)生LOH頻率>25%，由此我們推測(cè)D17S786位點(diǎn)是卵巢癌發(fā)展中發(fā)揮著重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的腫瘤抑制因子，它可能是一個(gè)卵巢癌高發(fā)的基因標(biāo)志物。但能否最終應(yīng)用于臨床上作為診斷卵巢癌的特異性基因標(biāo)志物還需進(jìn)一步作大量深入的研究及隨訪調(diào)查證實(shí)。

(本文圖1見(jiàn)封三)

[1] 薛建祥，龔波，俞菁，等．乳腺癌患者血清游離DNA的定量檢測(cè)[J]．腫瘤，2011，31(12)：1099-1102．

[2] 成凡，楚雍烈，賀大林，等．尿脫落細(xì)胞6號(hào)染色體長(zhǎng)臂的微衛(wèi)星改變?cè)\斷膀胱腫瘤[J]．第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24(8)：693-695．

[3] 趙心亮，田廣明，田亞平．人體循環(huán)游離DNA應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]．臨床檢驗(yàn)雜志，2013，31(2)：109-114．

[4] 王靖，張煦，徐星榕，等．宮頸癌染色體雜合性缺失和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性分析[J]．西北國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志,2009,3(30):174．

[5] 張國(guó)玲，陳鳴之，楊慧娟，等．上皮性卵巢腫瘤中 3P14 、3P25 雜合性丟失[J].中國(guó)癌癥雜志，2011,11(5)：416-417．

[6] 劉爭(zhēng)，趙華，羅志永，等．乳腺癌與癌前病變微衛(wèi)星DNA雜合性缺失研究[J]．中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011，15(4)：592-595．

[7] 劉銘，曾會(huì)昌，張曉莉．食管鱗狀細(xì)胞癌及癌前病變組織中多個(gè)染色體區(qū)域微衛(wèi)星雜合性缺失的研究[J]．中華外科雜志，2008，46(17)：1337-1339．

Diagnostic value of serum circulating DNA microsatellite LOH for cervical cancer and ovarian cancer

ZhuLiying,LiuXin,YuanJing,LiuLirong.

DepartmentofClinicalLaboratoryScience,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,China.

Objective To explore the efficiency of serum circulating DNA microsatellite LOH in the diagnosis of cervical cancer and ovarian cancer. Methods Six sites of microsatellite were selected. Serum circulating DNA (c-DNA) was extracted with blood genomic DNA extraction kit. LOH were detected with polymerase chain reaction (PCR) and denaturing polyacry1amide gelelectrophoresis in 63 cases of varian cancer, 33 cases of ovarian cancer (pathological group), 63 cases of hysteromyoma (benign group) and 63 healthy adult women serum (healthy control group). Results The rates of LOH on cervical cancer at D3S1038, D3S1300 and D3S1228 were 53.4%, 60.3% and 57.1% respectively. The rates of LOH on ovarian cancer at D17S579, D17S855 , D17S786 and D3S1038 were 45.5%, 42.4%, 27.3% and 51.3% respectively. Significant difference was observed in LOH between pathological group and healthy control group at all the sites (P<0.05). There was significant difference in LOH rates between benign group and cervical cancer at D3S1228, and between benign group and ovarian cancer at D17S579 and D17S855 (P<0.05). Conclusion LOH on D3S1228 are common in cervical cancer ,and LOH on D17S579 and D17S855 are common in ovarian cancer. This study could provide the experimental basis for further study on serum c-DNA as auxiliary diagnostic indicators of cervical cancer and ovarian cancer.

Circulating DNA; Cervical cancer; Ovarian cancer; Loss of heterozyosity

貴州省科學(xué)技術(shù)基金[黔科合J字(2011)2233號(hào)]

R737.31；R737.33

A

1000-744X(2016)01-0011-02

2015-10-21)

△通信作者，E-mail:249018257@qq.com