狼毒大戟石油醚提取物對小鼠肝臟細胞凋亡及p-ERK、Bcl-2、Bax、半胱氨酸蛋白酶-3的影響

蔡珍珍　金　銘　楊盼盼　劉吉成

(齊齊哈爾醫學院精神衛生學院，黑龍江　齊齊哈爾　161006)

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狼毒大戟石油醚提取物對小鼠肝臟細胞凋亡及p-ERK、Bcl-2、Bax、半胱氨酸蛋白酶-3的影響

蔡珍珍金銘1楊盼盼劉吉成1

(齊齊哈爾醫學院精神衛生學院，黑龍江齊齊哈爾161006)

摘要〔〕目的探討狼毒大戟石油醚提取物對小鼠肝臟細胞凋亡及磷酸化細胞外信號調節激酶(p-ERK)、Bcl-2、Bax、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3表達的影響。方法80只昆明種小白鼠隨機分為低劑量組、中劑量組、高劑量組和植物油對照組，每組20只。采用腹腔注射法給藥，1次/d(0.39、0.78、1.55 mg·kg-1·d-1)。于實驗第14天分別進行體重測量，對小鼠肝臟組織進行HE染色，TUNEL法原位標記凋亡細胞，采用免疫組織化學染色檢測Bcl-2、Bax蛋白表達，Western印跡法檢測p-ERK、Caspase-3蛋白表達。實時定量PCR對Bcl-2、Bax、Caspase-3進行定量分析。結果與植物油對照組比較，高劑量組小鼠體重明顯下降，肝臟細胞發生明顯凋亡，p-ERK、Bcl-2表達下調，Bax表達上調(P<0.05)，Caspase-3產生活化形式的Cleaved-Caspase-3。結論狼毒大戟石油醚提取物可使小鼠肝臟細胞發生凋亡，其機制可能與降低p-ERK、Bcl-2，增強Bax蛋白表達，并使Caspase-3產生活化形式的Cleaved-Caspase-3有關。

關鍵詞〔〕狼毒大戟；凋亡；Bcl-2

1齊齊哈爾醫學院醫藥科學研究院多基因病研究所

第一作者：蔡珍珍(1982-)，女，碩士，助理研究員，主要從事抗腫瘤、抗抑郁藥物研究。

狼毒大戟是大戟科植物，文獻報道稱，狼毒大戟可用于治療肝癌、肺癌、胃癌等惡性腫瘤，對結核桿菌也有較好的抑制作用〔1〕，臨床療效顯著，并未發現對心、肝、腎等系統的不良反應。本實驗使用狼毒大戟石油醚提取物，對昆明種小鼠進行體內試驗，發現其對小鼠肝臟具有一定的毒性。

1材料與方法

1.1動物、藥品、試劑及儀器近郊系昆明種小白鼠，雄性，清潔級，體重(20±2)g，由吉林大學實驗動物中心提供。狼毒大戟石油醚提取物，由齊齊哈爾醫學院藥物研究所提供，使用植物油將藥物配制成所需濃度，過濾備用。免疫組化染色：一抗(康為生物有限公司，兔抗小鼠Bax單克隆抗體，兔抗小鼠Bcl-2單克隆抗體)免疫組化SP試劑盒、DAB顯色劑、PBS緩沖液(購于康為生物有限公司)。逆轉錄試劑盒SYBR? ExScriptTM RT-PCR Kit(Pefect Real Time)、PCR試劑盒RNAiso Reagent(購于寶生物工程有限公司)。Western印跡：一抗(北京中杉金橋生物技術有限公司，兔單克隆抗體ERK、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3。PCR System 擴增儀2700(Applied Biosystems公司)，熒光定量PCR儀ABI 7300(ABI 公司)。光學顯微鏡CX31R BSF(Olympus)，圖像分析系統 DP801(Alphamiager公司)，DK-8D型電熱恒溫水浴箱(上海合恒儀器設備有限公司)，METTLER TOLEDO PH測試儀(上海秋騰貿易有限公司)，79-1磁力加熱攪拌器(上海雷磁新涇儀器有限公司)，THZ-82型恒溫振蕩器(江蘇太倉醫療器械廠)，AL204電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，HL-2000電子雜交箱〔香港興萬電子儀器(廈門)有限公司〕，SF-300型手壓式封口機(海旗榮實業有限公司)，24DN制膠器(北京市六一儀器廠)，TS-100脫色搖床(南京庚辰科學儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組近郊系昆明種小白鼠80只，實驗開始前進行適應性喂養，保持環境安靜，溫度保持在18～20℃，自然光線，實驗小鼠未發現有孕，狀態良好。隨機分為四組：植物油對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組20只。

1.2.2給藥參照文獻〔2〕LD50測定值，給予腹腔注射，低、中、高劑量組給藥量分別為0.39、0.78、1.55 mg·kg-1·d-1，植物油對照組給予等體積植物油。連續注射14 d，不禁食水，末次給藥后禁食16～20 h，斷頸處死小鼠，取肝臟組織置于冰生理鹽水中充分洗滌，濾紙吸干，稱取肝組織備用。

1.2.3TUNEL法檢測小鼠肝臟組織凋亡石蠟包埋的肝臟組織，采用末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT酶)介導的帶熒光的dUTP缺口末端標記法檢測。根據凋亡陽性細胞分布情況，每張切片取10個陽性視野，每個視野以30個細胞中陽性細胞數來計數，平均陽性細胞所占百分比，即細胞凋亡率(AR)。

1.2.4免疫組織化學法檢測Bcl-2、Bax取石蠟包埋的肝臟組織，相應部位連續切片各5張，采用過氧化物酶標記的鏈霉卵白素(SP)法進行免疫組織化學染色，并DAB顯色，通過蘇木素復染、水洗、鹽酸乙醇分化后返藍，常規脫水、透明、中性樹膠封片。每一張切片在陽性表達區域挑選10個無重疊視野，使用Olympus顯微鏡、DP801形態分析軟件進行圖像采集處理，圖像分析儀進行分析，測出Bcl-2、Bax蛋白抗原表達的總面積、陽性細胞數和平均吸光度A，計算其積分吸光度(IA)。

1.2.5Western印跡法檢測磷酸化細胞外信號調節激酶(p-ERK)、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達按每泳道加入總蛋白4 μg進行SDS-PAGE凝膠電泳，目標蛋白轉移至硝酸纖維素濾膜上，4℃封閉過夜，加入一抗p-ERK、Bcl-2、Bax、Caspase-3，溫箱孵育2 h，漂洗后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗1∶5 000，經過ECL化學發光劑曝光顯影，每組實驗重復三次，結果使用Gel-Pro4軟件進行半定量分析，計算相對光密度值。

1.2.6檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3基因的表達取凍存肝臟組織4℃解凍以后，放入DEPC處理的EP管中，在低溫冰塊上將其剪碎，加入1 ml Trizol液體進行組織勻漿。提取總RNA：按照RNAiso Reagent 試劑盒提取小鼠肝臟組織總RNA，通過紫外分光光度計以及瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的純度、濃度及其完整性。逆轉錄反應：按照SYBR? ExScriptTM實時定量PCR Kit反轉錄試劑盒操作方法進行實驗：反轉錄反應42℃,15 min，反轉錄酶失活反應95℃，2 min。PCR反應：采用SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)kit試劑盒相應反應體系，總體積為25 μl。引物的序列如下：Bcl-2正義鏈：5′-AAGCACATCCAATAAAAGCGC-3′，Bcl-2，反義鏈：5′-GTTATCATACCCTGTTCTCCCG-3′，Bax正義鏈：5′-GAGACACCTGAGCTGACCTTG-3′,Bax反義鏈：5′-GAAGTTGCCATCAGCAAACAT-3′，Caspase-3，反義鏈：5′-AAGGAGCAGCTTTGTGTGTGT-3′,Caspase-3，反義鏈：5′-AAGAGTTTCGGCTTTCCAGTC-3′；GAPDH正義鏈：5′-GACAATTTTGGCATCGTG-3′,GAPDH反義鏈：5′-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3′。分別擴增Bcl-2、Bax、Caspase-3和GAPDH，每個樣本做3個復孔，得到閾循環值(Ct)平均值，計算ΔΔCt值，各個樣本mRNA表達水平均以2-ΔΔCT表示。

1.3統計學方法運用SPSS13.0軟件包行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。

2結果

2.1肝臟細胞凋亡計數見圖1。經過TUNEL染色以及蘇木精復染以后，凋亡細胞呈現棕褐色，正常細胞核呈現藍染。植物油對照組僅可見極少數散在的凋亡細胞，高劑量組凋亡細胞數明顯增加。

圖1　小鼠肝臟細胞TUNEL檢測(×100)

圖2　小鼠肝臟組織中Bcl-2蛋白表達(DAB，×100)

圖3　小鼠肝臟組織中Bax蛋白表達(DAB，×100)

2.2肝臟組織中Bcl-2、Bax蛋白表達 如圖2，圖3所示，Bcl-2、Bax主要表達于細胞質，經圖像分析系統分析測得的(IA)值Bcl-2表達隨給藥劑量增加而降低，Bax與Bcl-2的表達呈相反狀態，差異有統計學意義(P<0.05)，但低、中劑量組間無差異(P>0.05)。

2.3各組小鼠肝臟組織中p-ERK、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達小鼠肝臟組織中的p-ERK蛋白隨劑量增加表達降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白低劑量組變化不明顯，中、高劑量組Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05)，Bax蛋白低劑量組變化不明顯，中、高劑量組表達明顯增高(P<0.05)，該提取物可以使Caspase-3活化，產生活性形式的Cleaved Caspase-3，低劑量時不促進Caspase-3及活化的Caspase-3蛋白表達，中、高劑量組Caspase-3及活化的Cleaved Caspase-3蛋白均增高(P<0.05)。見圖4。

2.4小鼠肝臟組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA含量與植物油對照組相比，高劑量組中Bcl-2明顯下調，而Bax明顯上調(P<0.05)，并呈劑量依賴關系，隨劑量增高Bax/Bcl-2比值增大。Caspase-3隨劑量增加而呈上調趨勢。見表1～表3。

1～4：植物油對照組、低、 中、高劑量組圖4　小鼠肝臟組織中凋亡相關蛋白檢測

組別CTBcl-2CTGAPDHΔCTBcl-2ΔCTGAPDHΔΔCTBcl-2相對表達量植物油對照組17.21±0.3115.12±0.12-17.29±0.16-17.78±0.120.49±0.050.71低劑量組17.35±0.2315.09±0.05-17.35±0.21-17.81±0.130.66±0.100.63中劑量組18.11±0.2115.04±0.09-16.39±0.19-17.86±0.091.47±0.100.362)高劑量組18.96±0.3315.11±0.11-15.54±0.2417.79±0.112.25±0.120.211)2)

與植物油對照組比較：1)P<0.05；與前一劑量組比較：2)P<0.05，下表同

表2　小鼠肝臟細胞Bax mRNA表達

表3　小鼠肝臟細胞Caspase-3 mRNA表達

3討論

狼毒大戟是一種有毒中藥，近年來許多學者都在其抗腫瘤、抗炎等方面進行了大量的研究，并且取得了實質性的進展。其原植物的水、醇、石油醚等的提取物均有抑制腫瘤發展的作用，報道稱其為高效低毒的藥品，但本實驗發現，其石油醚提取物對小鼠肝臟具有一定的毒性，解剖可見，肝臟大小無明顯變化，質地柔軟，無粘連，色澤光亮。顯微鏡下觀察肝臟組織變化不明顯。隨著給藥時間和劑量的增加，部分肝小葉內可見細胞核消失，細胞質成深紅濃染的嗜酸性小體。個別高劑量小組的小鼠狀態仍然良好。TUNEL法檢測的小鼠肝臟細胞，發現高劑量組中肝臟細胞發生明顯凋亡。

細胞的凋亡發生、發展，受到細胞內凋亡調節蛋白的調控與影響，細胞內凋亡調節蛋白分為促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白兩類，細胞是否發生凋亡取決于兩種蛋白相互拮抗失衡的狀態。目前已知的凋亡調節蛋白中，Bcl-2家族在各類刺激信號引發的凋亡中起到關鍵的作用〔3,4〕。在細胞線粒體上的Bcl-2與Bax蛋白水平的高低直接關系到細胞凋亡的發生，Bax促進細胞凋亡發生，Bcl-2抑制凋亡。于是有人提出細胞在受到刺激后所表現的的生存能力由Bcl-2與Bax兩者的比率決定〔5,6〕,Bcl-2表達水平較高時，比率上調，可形成Bcl-2/Bax的異二聚體，抑制細胞凋亡；Bax表達水平較高時，比率下調，形成Bax/Bax同二聚體，促進細胞凋亡〔6〕。近年來，許多機構的研究表明細胞凋亡的內在變化有一定的規律〔7～10〕。

目前在人類已鑒定了4條MAPK途徑：細胞外信號調節蛋白激酶(ERK)途徑，C-Jun基末端激酶(JNK)/應激活化蛋白(SAPK)途徑，ERK5/大絲裂素活化蛋白激酶1(BMK1)途徑和p38 MAPK(p38 MAPK)傳導途徑〔11〕。其中ERK通路主要被分裂原激活,如生長因子與受體結合后,能激活小G蛋白Ras,進而激活Raf→MEK→ERK通路。Ketam等〔12,13〕認為，抑制P38通路的同時可以加強ERK的激活，導致細胞凋亡發生延遲。該實驗中，p-ERK蛋白的表達隨劑量的增加而降低，有可能參與了凋亡反應的調控。

Caspase是哺乳動物細胞發生凋亡的啟動、執行者〔14〕，其中Caspase-3是該酶家族級聯下游最關鍵的凋亡調節蛋白酶，Bcl-2通過干擾細胞色素C的釋放進而阻斷上游Caspase蛋白酶的激活，從而抑制細胞凋亡的發生〔15〕。Bax作為線粒體膜上離子離子通道的組成部分，使得細胞色素C得以順利穿過線粒體膜而激活Caspase-9蛋白，進一步激活Caspase-3，最終引起細胞凋亡。

本實驗結果證明，狼毒大戟石油醚提取物對小鼠的肝臟細胞產生一定的毒性，隨著給藥劑量的增加，小鼠肝臟組織發生病理改變，從分子層面上講，Caspase-3、Bax蛋白表達逐漸的增加，說明狼毒大戟石油醚提取物直接或者間接通過別的信號途徑激活了Caspase-3、Bax，并使Bax/Bcl-2比率下調，細胞凋亡明顯增多，這一結果與TUNEL的檢驗結果相一致。其毒性作用機制可能是通過ERK通路調節線粒體上的Bcl-2、Bax蛋白的表達，最終活化Caspase-3，啟動凋亡程序。

狼毒大戟是一種近年來研究較多的抗炎、抗腫瘤藥物，通過該實驗證實了，其存在一定的毒性，但是就其當下對抗腫瘤的效果來說，期待能夠通過藥物配伍達到提高抗炎、抗腫瘤，并成功減毒的效果。使其在發揮新的藥物功能的同時更好地服務于醫療衛生事業。

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〔2014-09-19修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

·基礎研究·

Effect of petroleum ether extracts of Euphorbia fischeriana on the liver cell apoptosis and the expression of p-ERK，Bcl-2，Bax and Caspase-3 in mice

CAI Zhen-Zhen, JIN Ming, YANG Pan-Pan,etal.

Institute Mental Health，Qiqihaer Medical College，Qiqihaer 161006，Heilongjiang, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of petroleum ether extracts of Euphorbia fischeriana on the liver cells apoptosis in mice and the expressions of phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (p-ERK)，Bcl-2，Bax,Caspase-3 in the liver of mice.MethodsEighty Kunming mice were randomly divided into low dose, middle dose, high dose and the control groups with vegetable oil(0.39, 0.78, 1.55 mg·kg-1·d-1)，20 in each group. Model was made by intraperitoneal injection 1 time/day. In the experiment of 14 days，weight was measured, HE dyeing was used to detect liver pathologic morphology, TUNEL was used to detect liver cell apoptosis. Bcl-2 and Bax protein expression were tested by immunohistochemical staining method. The protein expressions of p-ERK and Caspase-3 were detected by western blot. Real-time PCR was used for quantitative analysis of Bcl-2, Bax and Caspase-3.ResultsCompared with the control group, the weights were decreased significantly, liver cell apoptosis was more obvious, the protein expressions of p-ERK and Bcl-2 were decreased while Bax were increased, the protein expressions of Caspase-3 was activated to Cleaved-Caspase-3 in high dose group(P<0.05).ConclusionsPetroleum ether extracts of Euphorbia fischeriana could result in apoptosis of liver cells in mice. The mechanism may be related to reduce p-ERK and Bcl-2, enhance Bax protein expression, and produce activated Caspase-3 forms of Cleaved-Caspase-3.

【Key words】Euphorbia fischeriana；Apoptosis；Bcl-2

通訊作者：劉吉成(1958-)，男，教授，博士生導師，主要從事抗腫瘤藥物研究。

基金項目：國家自然科學 (81573660)

中圖分類號〔〕R285〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2016)01-0001-05；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.001