山臘梅提取物對慢性阻塞性肺病大鼠炎癥細胞、C反應蛋白、白細胞介素-8水平的影響

湯　森　胡建軍　劉　多　彭　霞　迪麗沙·迪力夏提　彭英福

(吉首大學醫學院，湖南　吉首　416000)

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山臘梅提取物對慢性阻塞性肺病大鼠炎癥細胞、C反應蛋白、白細胞介素-8水平的影響

湯森胡建軍劉多彭霞迪麗沙·迪力夏提彭英福

(吉首大學醫學院，湖南吉首416000)

摘要〔〕目的觀察山臘梅莖水提物對慢性阻塞性肺病(COPD)模型大鼠炎癥細胞和C-反應蛋白(CRP)、白細胞介素(IL)-8的影響。方法采用反復煙熏加內毒素氣管內滴入法復制COPD大鼠模型，將60只SD大鼠隨機分為五組：正常組、模型組和低、中、高劑量山脂梅組。模型組及正常組給予生理鹽水灌胃，山臘梅組分別給予低、中、高劑量進行灌胃，療程21 d。觀察各組大鼠肺組織的病理學改變，測定各組支氣管肺泡灌洗液白細胞計數、中性粒細胞比率及各組血清和肺組織中CRP、IL-8水平。結果模型組大鼠出現慢性支氣管炎特征性病理改變明顯，氣管及血管周圍有大量炎癥細胞浸潤，肺氣腫明顯，低、中、高劑量治療組肺氣腫和炎癥浸潤較模型組有明顯減輕，正常組大鼠肺組織結構基本正常。模型組大鼠肺組織和血清CRP、IL-8較正常對照組顯著增多，高、中、低劑量山臘梅組大鼠肺組織和血清CRP、IL-8均明顯較模型組減少(P<0.05)。模型組中白細胞總數及中性粒細胞比率較各山臘梅組增加(P<0.01)，各山臘梅組白細胞計數及中性粒細胞較正常組明顯增多(P<0.01)。結論山臘梅莖水提物可降低COPD大鼠肺組織和血清中CRP及IL-8水平，對COPD大鼠的炎癥有抑制作用。

關鍵詞〔〕C-反應蛋白；慢性阻塞性肺?。簧脚D梅莖水提物；支氣管肺泡灌洗液

第一作者：湯森(1993-)，男，在讀碩士，主要從事民族藥物教學與研究。

山臘梅葉具有抗菌消炎、止咳化痰、清熱排毒、抗病毒、助消化、止瀉、減肥、消脂降壓、預防心腦血管疾病以及增強機體免疫力等作用，對其作用機制的研究提示山臘梅葉可減少腫瘤壞死因子(TNF)-α及白細胞介素(IL)-8、IL-10等生成〔1〕。對山臘梅的藥理基礎研究及其開發仍局限于山臘梅葉，而對山臘梅莖、花、根的藥理學研究未見報道。長期以來，山臘梅對慢性阻塞性肺病(COPD)的治療缺乏深入研究。本研究探討山臘梅莖對COPD大鼠炎癥的影響及其作用機制。

1材料和方法

1.1山臘梅莖水提物的提取在湘西吉首地區采集山臘梅，由我院中藥學李春艷教授鑒定。稱取陰干后的山臘梅莖1 000 g，粉碎，約60℃水提3次，每次120 min，合并水煎液，濃縮為1 g生藥/ml，得到山臘梅莖水提物。

1.2實驗動物與分組清潔級SD大鼠60只，雌雄兼用，湖南長沙市開福區東創實驗動物科技服務部購買，動物編號HNACSDC20120292，鼠齡13 w，體重(280±20) g。隨機分為：正常組(n=12)、模型組(n=12)和低劑量山臘梅組(n=12)，中劑量山臘梅組(n=12)、高劑量山臘梅組(n=12)。實驗中大鼠死亡3只，進入統計動物數實為57只。

1.3COPD模型制備方法采用兩次氣管內注入脂多糖(LPS)和反復煙熏的方法制作COPD大鼠模型。第1、14天淺麻醉后向氣管內緩慢注入脂多糖200 μg (200 μl)/只，將大鼠放入自制的有機玻璃染毒箱(120 cm×100 cm×100 cm)內，在其正下方開一個4 cm×2 cm的通氣孔。將煙葉點燃后放入煙熏箱中(煙葉購于吉首農貿市場)，大鼠每天吸煙2次，每次煙葉用量250 g，時間30 min，2次間隔4 h，連續28 d。用藥組：大鼠吸煙染毒8 d后每天吸煙染毒前予以山臘梅莖水提物灌胃(低劑量組原藥0.5 ml+生理鹽水1.5 ml/每次，中劑量組原藥1 ml+生理鹽水0.5 ml/每次，高劑量組原藥2 ml/每次)至造模結束，共20 d。正常組氣管內滴入等量生理鹽水及2 ml/d生理鹽水灌胃，28 d天后處死大鼠用于實驗觀察。

1.4血清及支氣管肺泡灌洗液(BALF)的采集將大鼠用2%的戊巴比妥鈉(25 mg/kg)麻醉后仰臥固定于操作臺，切開胸部，暴露出氣管和雙肺，從頸總動脈插管取血后，3 500 r/min，離心10 min，取上清液血清于-85℃低溫冰箱保存。結扎右主支氣管，在隆突上用套管針穿刺至左肺，緩慢注入無菌生理鹽水3 ml，每次注入后立即回吸得到BALF，重復3次。灌洗液紗布過濾，回收率為60%～70%，混勻灌洗液做白細胞計數和中性粒細胞計數比率測定。

1.5肺組織勻漿制備取適量肺組織，冰生理鹽水漂洗兩次，濾紙吸干、稱重、剪碎，加入9倍冰生理鹽水，超聲勻漿器制成10%勻漿，低溫離心機4 000 r/min離心10 min，取上清液，置于-85℃冰箱中保存至生化指標檢測。

1.6病理學檢查實驗各組于吸煙染毒結束后取每只大鼠右中葉肺組織，10%中性福爾馬林固定后，常規石蠟包埋切片，HE染色。在400倍光鏡下，隨機選取5個視野，根據文獻〔2〕對氣道炎癥進行病理學評分。病理學檢查由湘西州人民醫院病理科進行，采用單盲法。

1.7血清和肺組織勻漿中C-反應蛋白(CRP)、IL-8水平檢測利用H6000-020全自動生化分析儀，大鼠CRP試劑盒、IL-8試劑盒購于武漢博士德生物有限公司，嚴格按照說明書操作步驟進行檢測。

2結果

2.1一般情況實驗前各組大鼠體重差異無統計學意義(P>0.05)，造模開始后模型組大鼠食量下降、活動減少，毛色暗黃，出現慢性咳、喘癥狀，體重較正常組顯著減輕(P<0.01)；給藥組較模型組進食增多，咳、喘減輕，活動增多，體重增加，但仍不及正常組(P<0.01)(表1)。

表1　各組大鼠體重比較

與實驗后正常組比較：1)P<0.01；與實驗后模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；與中劑量山臘梅組比較：4)P<0.01

2.2病理改變大體觀察，模型組大鼠肺較正常組顏色蒼白，體積增大；鏡檢結果(圖1)：正常組大鼠肺組織未見明顯異常改變，模型組大鼠血管充血明顯并累及周圍肺泡，肺泡腔明顯擴張，肺泡壁出現斷裂，氣道壁及管腔內有大量炎性細胞滲出，黏液滲出阻塞氣道，支氣管黏膜上皮脫落、壞死。低、中及高劑量山臘梅組大鼠的支氣管充血、黏膜上皮脫落、炎性細胞浸潤以及肺泡腔擴大情況較模型組減輕，較正常組重。氣道炎癥病理學總評分模型組高于正常組(72.5±13.9 vs 13.6±2.6，P<0.000 1)，山臘梅干預后病理評分下降，(低、中、高劑量山臘梅組評分分別為51.6±14.7、46.8±11.3、37.9±9.5)但仍高于正常組(P<0.05)。

2.3各組大鼠BALF白細胞總數及中性粒細胞比率模型組中白細胞總數增加，與正常組比較差異顯著(P<0.01)。各山臘梅組炎癥細胞總數較模型組明顯減少(P<0.01)。與正常組比較，模型組和各山臘梅組中白細胞總數和中性粒細胞比率均顯著升高，與模型組比較，各山臘梅劑量組白細胞總數和中性粒細胞比率均顯著下降，并呈一定的劑量效應關系(P<0.01)(表2)。

模型組

正常組

低劑量山臘梅組

中劑量山臘梅組

高劑量山臘梅組

表2　各組大鼠BALF白細胞總數、中性粒細胞比率比較±s)

與模型組比較:1)P<0.01；與高劑量山臘梅組比較：2)P<0.01；與中劑量山臘梅組比較：3)P<0.01；下表同

2.4血清中CRP、IL-8的測定模型組血清CRP明顯較正常組增多(P<0.01)。高、中、低劑量山臘梅組血清CRP均較模型組明顯減少(P<0.05或0.01)。低、中劑量山臘梅組間血清CRP水平無明顯差異(P>0.05)，高與低劑量山臘梅組比較，差異顯著(P<0.05)(表3)。

表3　各組大鼠血清CRP、IL-8水平比較

2.5各組大鼠肺組織勻漿中CRP、IL-8的測定模型組大鼠肺組織CRP、IL-8明顯較正常組增多(P<0.01)。各山臘梅組肺組織CRP、IL-8均明顯較模型組減少(P<0.05)。低、中劑量山臘梅組間血清CRP、IL-8水平無明顯差異(P>0.05)。高低劑量山臘梅組比較差異顯著(P<0.05)(表4)。

表4　各組大鼠肺組織勻漿中CRP、IL-8比較

3討論

吸煙和反復下呼吸道感染是COPD發生發展的主要原因〔3〕。本實驗通過熏吸香煙加氣管內注射LPS法建立COPD大鼠模型，結果符合COPD病理改變，說明造模成功，且山臘梅對COPD的氣道炎癥有一定的緩解作用。

氣道炎癥(尤其是小氣道的炎癥)是COPD的基礎性病變，以中性粒細胞為主〔4〕的氣道炎癥在其發病過程中起著非常重要的作用。中性粒細胞在COPD氣道腔內聚集增加，并通過釋放蛋白酶如基質金屬蛋白酶、氧自由基等引起組織損傷 參與COPD 氣流阻塞的形成。IL-8在中性粒細胞激活的過程中起著重要的作用，它可以激活中性粒細胞多方面的功能，可以作為評估呼吸道炎癥和受損程度的一個指標。在COPD發病過程中，IL-8在中性粒細胞所致炎癥中起了相當重要的作用，IL-8水平與氣流阻塞程度、氣道的炎癥相匹配〔5〕。本研究提示中性粒細胞的活化和聚集是慢性支氣管炎與肺氣腫炎癥過程的一個重要環節，利用山臘梅干預后，中性粒細胞明顯減少，提示該藥物對煙熏加脂多糖誘發大鼠COPD模型有顯著減少白細胞數量的作用，呈現一定的劑量效應關系。本實驗說明山臘梅水提物能降低慢性阻塞性大鼠血清及肺組織中IL-8的表達，減少炎性細胞因子的釋放，從而控制氣道炎癥。

CRP是一種對多種刺激因素包括感染、組織損傷、壞死都能迅速發生反應的蛋白，?？勺鳛橐环N反應炎癥、組織損傷程度以及評價治療反應的非特異性敏感指標〔5〕。本實驗結果提示CRP不僅對COPD具有慢性表達，是COPD病情的重要生物學標志，且山臘梅對大鼠COPD模型大鼠的抗炎作用與減少COPD病變中IL-8及CRP有關。

參考文獻4

1李莎莎，舒任庚.山臘梅化學成分及藥理作用的研究進展〔J〕.華西藥學雜志，2009;24(2):198-200.

2Lee SY，Park KH，Oh KJ，etal.The relationship of serum C-reactive protein and clinical chorioamnionists，funisitis，and early onset neonatal sepsis in preterm delivery 〔J〕.Am J Obstet Gynecol，2011;204：S210.

3周新.COPD發病機制研究進展〔J〕.臨床肺科雜志,2001;93(6):47-8.

4Gallelli L，Pelaia G，Fratto D，etal.Effects of budesonideon P38MAPK activation，apoptosis and IL-8 secretion，induced by TNF alpha and H aemophilus influenzae in human bronchial epithelial cells〔J〕.Int J Immunopathol Pharmacol，2010;23(2)：471-9.

5Dulay A，Buhimsch I，Zhao GM，etal.Systematic evaluation of prototype acute phase reactants 〔Interleukin-6(IL-6)，C-reactive protein (CRP) and procalcitonin (PCT)〕 as non-invasive biomarkers of intra-amniotic infection (IAI)〔J〕.Am J Obst Gynecol，2011;204：S248.

〔2014-08-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

通訊作者：彭英福(1968-)，男，碩士，講師，主要從事民族藥物教學與研究。

基金項目：湖南省教育廳大學生創新性課題基金資助(湘教通〔2012〕141號)；吉首大學 (JSU-CX-2012-44)

中圖分類號〔〕R361；R932〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2016)01-0026-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.011