山楂葉總黃酮對(duì)慢性腦缺血大鼠腦組織c-fos、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

吳曉光　檀榮方　楊　嵐　李蒙蒙　張?zhí)禅潯垺?qiáng)

(河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點(diǎn)研究室，河北　承德　067000)

?

山楂葉總黃酮對(duì)慢性腦缺血大鼠腦組織c-fos、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

吳曉光檀榮方楊嵐李蒙蒙張?zhí)禅潖垙?qiáng)

(河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點(diǎn)研究室，河北承德067000)

摘要〔〕目的探討山楂葉總黃酮(TFHL)對(duì)慢性腦缺血大鼠的治療作用及機(jī)制。方法健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、TFHL組、銀杏葉片組。采用永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法制備腦缺血模型。免疫組化法檢測(cè)c-fos蛋白的表達(dá)，Western印跡法檢測(cè)Bcl-2蛋白的表達(dá)，原子分光光度法檢測(cè)腦組織Ca2+含量。結(jié)果與模型組比較，TFHL顯著抑制大鼠缺血腦組織c-fos蛋白表達(dá)(P<0.01)，增加Bcl-2蛋白表達(dá)(P<0.05)，降低Ca2+含量(P<0.05)。結(jié)論TFHL對(duì)慢性腦缺血的保護(hù)作用與抑制腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)，其抗凋亡的機(jī)制可能與上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)c-fos表達(dá)，降低腦組織Ca2+含量有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕山楂葉總黃酮；慢性腦缺血；c-fos；Bcl-2；Ca2+

第一作者：吳曉光(1975-)，男，碩士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥抗癡呆機(jī)制研究。

細(xì)胞凋亡與缺血性腦損傷的關(guān)系極為密切。腦缺血后，c-fos的過(guò)度表達(dá)能阻斷細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)而產(chǎn)生一些促調(diào)亡因子〔1〕，參與腦缺血損傷后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡過(guò)程。Bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡因子，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，抑制或減少損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡成為缺血性腦血管病治療的關(guān)鍵〔2〕。山楂葉總黃酮(TFHL)是從山楂葉中提取的黃酮類化合物，具有降血脂、抗氧化等〔3〕功能，但其對(duì)c-fos和Bcl-2基因表達(dá)的影響尚不清楚。本研究采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法制備慢性腦缺血模型，觀察TFHL對(duì)腦缺血大鼠c-fos、Bcl-2表達(dá)的影響，并探討其可能機(jī)制，為防治缺血性腦血管病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1藥物與試劑摘采承德本地7～8月份的山楂樹(shù)葉，采用水煎醇沉法〔4〕提取TFHL，純度為65.2%。c-fos、Bcl-2多克隆抗體(武漢博士德生物科技有限公司)，DAB顯色試劑盒(北京中山金橋生物科技有限公司)。

1.2動(dòng)物模型制備及分組清潔級(jí)SD大鼠72只，雄性，體質(zhì)量250～300 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供〔格證號(hào)：scxk(京)2012-0001〕。隨機(jī)分等為四組：假手術(shù)組、模型組、TFHL組、銀杏葉片組。采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法建立大鼠腦缺血模型〔5〕，假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎。術(shù)后第7天開(kāi)始，TFHL組及銀杏葉片組大鼠分別灌胃給予TFHL 140 mg·kg-1·d-1和銀杏葉片12.3 mg·kg-1·d-1，共21 d。假手術(shù)組及模型組給予等量的生理鹽水。

1.3觀察指標(biāo)及方法

1.3.1免疫組化檢測(cè)c-fos蛋白的表達(dá)末次給藥后1 h，4%水合氯醛麻醉，10% 甲醛心臟灌注固定，取視交叉后2～8 mm之間的腦組織，常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚冠狀面切片。切片經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，0.3%H2O2孵育30 min，山羊血清封閉30 min，滴加c-fos一抗(1∶100)40 μl，4℃冰箱過(guò)夜，生物素標(biāo)記羊抗兔IgG 50 μl孵育30 min，DAB顯色5 min，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察，拍片。MINT圖像分析系統(tǒng)分析陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物的光密度值。

1.3.2Western印跡法檢測(cè)Bcl-2蛋白的表達(dá)末次給藥后1 h，0.01 mol/L PBS洗凈血液，加入裂解液和10 μl PMSF(10 mg/ml)，4℃勻漿，10 000 r/min，離心30 min ，取上清液，BAC蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。再經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、10%脫脂奶粉封閉，加Bcl-2一抗(1∶150)4℃過(guò)夜，HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 000)室溫孵育2.5 h，Super ECL Plus 超敏發(fā)光液發(fā)光，X線片暗盒內(nèi)曝光，D72顯影液顯影，利用Quantity One軟件分析X線膠片的灰度值。

1.3.3原子分光光度法檢測(cè)Ca2+含量末次給藥后1 h，大鼠斷頭，取腦組織，剝離軟腦膜，超純水漂洗，去除殘余血液，60℃溫箱烘烤48 h，分析天平稱重，滴加濃硝酸，逐漸全部消化成溶液，取樣，1%CaCl2稀釋，利用原子分光光度法檢測(cè)樣品Ca2+含量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1各組大鼠腦組織c-fos蛋白的表達(dá)與假手術(shù)組比較，模型組c-fos蛋白升高(324.78.94±50.37)%〔(0.046 3±0.005 83)，P<0.01〕；與模型組比較，銀杏葉片組(0.016 8±0.000 54)和TFHL組(0.017 6±0.000 61)的c-fos蛋白分別降低了(63.71±11.42)%和(61.98±11.27)%，具有顯著差異(P<0.01)；銀杏葉片組與TFHL組之間比較無(wú)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1，圖1。

圖1　各組大鼠腦組織c-fos蛋白的表達(dá)(DAB，×400)

2.2各組大鼠腦組織Bcl-2蛋白的表達(dá)假手術(shù)組(0.28±0.02)有少量的Bcl-2蛋白表達(dá)。與假手術(shù)組比較，模型組Bcl-2蛋白的表達(dá)升高(17.89±3.19)% (0.33±0.06，P<0.05)；與模型組比較，銀杏葉片組(0.70±0.08)和TFHL組(0.68±0.09)的Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯增高(112.12±6.14)%和(106.01±5.81)%，具有顯著差異(P<0.01)；銀杏葉片組與TFHL組之間比較無(wú)差異(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2　各組大鼠腦組織Bcl-2蛋白表達(dá)

2.3各組大鼠腦組織Ca2+的含量模型組大鼠腦組織Ca2+含量較假手術(shù)組顯著增加(117.20±5.18)%〔(231.51±11.47)vs(106.59±6.87)μg/g，P<0.01〕；與模型組比較，銀杏葉片組〔(142.32±5.17)μg/g〕和TFHL組〔(145.91±5.78)μg/g〕腦組織Ca2+含量分別降低了(38.53±2.13)%和(36.97±2.01)%，具有顯著性差異(P<0.05)；銀杏葉片組與TFHL組之間比較無(wú)差異(P>0.05)。

3討論

腦血管疾病是由各種病因引起腦血管損傷所導(dǎo)致的一組臨床疾病，其中缺血性腦血管疾病是最常見(jiàn)類型，其發(fā)病率、病

殘率和病死率高，并常常伴有學(xué)習(xí)及認(rèn)知功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。腦血管疾病常常引起大腦神經(jīng)功能缺失，而神經(jīng)細(xì)胞凋亡是造成腦神經(jīng)功能缺失的重要因素，抑制或減少損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡則是為缺血性腦血管病治療的關(guān)鍵〔2〕。c-fos基因是mys家族的一員，編碼核內(nèi)DNA結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。正常生理情況下，c-fos基因存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，處于低表達(dá)或靜止?fàn)顟B(tài)，不易檢測(cè)〔1〕。但在腦缺血損傷后，c-fos基因作為即刻早期反應(yīng)基因迅速作出反應(yīng)進(jìn)行表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物fos蛋白在生長(zhǎng)因子刺激下，促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，但c-fos過(guò)度表達(dá)時(shí)則會(huì)誘發(fā)細(xì)胞凋亡〔6，7〕；缺血還可促使Ca2+大量?jī)?nèi)流，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的損傷或死亡，導(dǎo)致腦神經(jīng)功能障礙。本研究結(jié)果顯示，腦缺血可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，表明TFHL可通過(guò)抑制c-fos蛋白過(guò)度表達(dá)，降低Ca2+超載，減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷。

Bcl-2是公認(rèn)的具有抑制細(xì)胞凋亡作用的蛋白，可以抑制Bax從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體膜，保護(hù)線粒體電勢(shì)梯度，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的自穩(wěn)狀態(tài)和氧化還原狀態(tài)從而抑制內(nèi)在凋亡途徑〔8〕。因此，Bcl-2蛋白表達(dá)量直接決定神經(jīng)細(xì)胞的存活與凋亡取向。本研究結(jié)果顯示，腦組織缺血缺氧，Bcl-2蛋白表達(dá)受到抑制，而c-fos過(guò)度表達(dá)，Ca2+超載，從而加快了神經(jīng)細(xì)胞凋亡。應(yīng)用山楂葉總黃酮可明顯增加缺血腦組織Bcl-2蛋白的表達(dá)，從而抑制或逆轉(zhuǎn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。因此，TFHL的作用機(jī)制可能與其抑制Ca2+超載，促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，減少促凋亡蛋白c-fos表達(dá)有關(guān)，但其減輕腦缺血誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，還需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)4

1趙雪花,曾墾.葛根素對(duì)大鼠腦缺血再灌注后Caspase-3和c-fos表達(dá)的影響〔J〕.數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志,2012;25(5):511-2.

2趙雅寧,李建民,張姍姍,等.參芪化瘀膠囊通過(guò)PI3-K/Akt信號(hào)通路改善大鼠缺血性腦損傷〔J〕.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版,2011；32(5):636-9.

3李紅,張爽,紀(jì)影實(shí),等.山楂葉總黃酮不同給藥途徑對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2012;32(3):995-7.

4王基平,孫華,李湘暉,等.脈炎消口服液的含量測(cè)定及藥理作用〔J〕.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2009;29(2):162-4.

5陳濤,周少華,劉南暖,等.促紅細(xì)胞生成素對(duì)慢性腦缺血大鼠認(rèn)知障礙及海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2013;33(4):1588-90.

6羅國(guó)標(biāo),劉曉麗,張中菊,等.青藤堿對(duì)偏頭痛模型大鼠腦干c-fos、c-jun表達(dá)的影響〔J〕.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2013;30(6):513-5.

7顏玲,黃德斌.黃芪多糖對(duì)缺血腦損傷大鼠海馬神經(jīng)遞質(zhì)及 c-fos mRNA表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)病理生理學(xué)雜志,2012;28(2):263-8.

8郭佳,肖傳實(shí),白瑞,等.脂聯(lián)素對(duì)大鼠缺血/再灌注心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2012;28(7):930-3.

〔2014-08-09修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目：河北省科技廳指令課題(152777890)；河北省教育廳青年基金指令課題(QN201403)；河北省高校省級(jí)重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目(2013年)；河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點(diǎn)研究室建設(shè)項(xiàng)目資助(2013年)

中圖分類號(hào)〔〕R749〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2016)01-0033-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.014