風濕性心臟病二尖瓣組織Th17細胞軸相關細胞因子表達水平

文　韻　桂　春　黃偉強　文　宏　韋　恒　鄭慧蕾　曾志羽

(廣西醫科大學第一附屬醫院老年心內科，廣西　南寧　530021)

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風濕性心臟病二尖瓣組織Th17細胞軸相關細胞因子表達水平

文韻桂春1黃偉強文宏韋恒鄭慧蕾曾志羽

(廣西醫科大學第一附屬醫院老年心內科，廣西南寧530021)

摘要〔〕目的探討慢性風濕性心臟病(RHD)患者心臟二尖瓣瓣膜上Th17細胞軸相關細胞因子白細胞介素(IL)-17、IL-21、IL-6、IL-23表達水平的改變。方法選擇 20例 RHD患者及12例非RHD對照組二尖瓣瓣膜組織(NRHD組)，應用蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組化法對IL-17、IL-21、IL-6、IL-23表達水平進行檢測。結果RHD組HE染色可見瓣膜組織部分出現纖維化和鈣化，局灶性散在的慢性炎性細胞浸潤，以淋巴細胞、漿細胞為主。免疫組織化學染色可見慢性炎性細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞存在IL-17、IL-21、IL-6、IL23的表達且定位于細胞質中，炎性細胞主要位于血管旁。RHD組 IL-17、IL-21、IL-6、IL23表達陽性細胞比例及其乘積評分均明顯高于NRHD組(P<0.05)。結論RHD患者瓣膜中Th17細胞相關細胞因子的表達明顯增高，高Th17表達可能是引起RHD持續瓣膜損害的一個潛在機制。

關鍵詞〔〕風濕性心臟病；Th17細胞；細胞因子

1廣西醫科大學第一附屬醫院西院心內科

第一作者：文韻(1990-)，女，在讀碩士，主要從事風濕性心臟病、冠心病方面的研究。

風濕性心臟病(RHD)是A組β溶血性鏈球菌感染引起的風濕熱(RF)的后遺癥，是一種自身免疫性疾病〔1〕，并與細胞因子相關聯〔2,3〕。Th17細胞作為最新被確認的效應細胞系，在防御細胞外細菌感染、介導慢性炎癥和自身免疫性疾病中發揮重要作用。越來越多的研究證明，Th17細胞參與類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、哮喘等〔4～6〕多種自身免疫性疾病的病理過程。但是Th17細胞及其效應因子在RHD中的表達目前尚未完全明確。本文擬初步探討Th17細胞在慢性RHD中的作用，為進一步闡明和完善RHD的發病機制提供依據。

1材料和方法

1.1材料來源隨機選取廣西醫科大學第一附屬醫院2013年10月至2014年3月行二尖瓣置換術的RHD患者20例為RHD組，男8例，女12例，年齡(50.30±1.786)歲。另外選取12例非RHD行二尖瓣置換術(退行性二尖瓣后瓣脫垂)患者二尖瓣前瓣瓣葉作對照(NRHD組)，男6例，女6例，年齡(58.58±2.204)歲。兩組選取病例均通過心臟超聲確診。本實驗所選取人體標本均通過病人及其家屬知情同意。兔抗人白細胞介素(IL)-17、IL-6、IL-23單克隆抗體采用Abcam公司產品，兔抗人IL-21單克隆抗體采用Novus公司產品，S-P免疫組化試劑盒采用北京中杉金橋公司產品，DAB顯色試劑盒采用福州邁新公司產品。

1.2標本制備兩組均在術中建立體外循環,心臟停跳后30 min內取材，立即放入4%多聚甲醛固定16 h后，移入脫鈣液中，浸泡至組織脫鈣軟化，常規石蠟包埋,連續切片厚4 μm,作蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組織化學染色。

1.3HE染色和免疫組化將石蠟切片進行HE染色，觀察炎癥細胞浸潤和組織學形態。同時石蠟切片常規脫蠟水化，抗原修復后再加入3%H2O2去離子水去除內源性過氧化物酶，置于正常山羊血清工作液中，室溫下封閉15 min，加入上述各單克隆抗體，4℃過夜后加入生物素標記山羊抗兔IgG抗體。上述每級抗體孵育后，使用PBS充分洗滌。DAB室溫下顯色5～10 min后，蘇木素染核、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察并計數。

1.4結果判定IL-17、IL-21、IL-6、IL-23均以細胞質內出現不同程度的棕黃色判定為陽性反應。以PBS取代一抗作為空白對照。采用許良中等〔7〕的半定量公式判斷染色結果。隨機選取5個典型高倍鏡視野(400倍)計數每個視野下細胞總數和陽性細胞的個數。首先就染色強度打分，以多數細胞呈現的染色特性(染色深淺的判定需要與背景著色深淺相比較)計分：棕褐色判為3分，棕黃色判為2分，淺黃色判為1分，無著色判為0分；再將陽性細胞所占百分比打分，陽性細胞比例的計算方法：陽性細胞/總細胞數×100%。0分為陰性，1分為陽性細胞≤10%，2分為陽性細胞11%～50%，3分為陽性細胞51%～75%，4分為陽性細胞≥75%。陽性細胞的百分比與染色強度的乘積>3分為免疫反應陽性。

1.5統計學處理采用SPSS16.0軟件行t檢驗。

2結果

2.1HE染色RHD組HE染色結果可見瓣膜組織部分出現纖維化和鈣化，局灶性散在的慢性炎性細胞浸潤，以淋巴細胞、漿細胞為主，見圖1。

2.2免疫組化染色慢性炎性細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞存在IL-17、IL-21、IL-6、IL23的表達且定位于細胞質中，炎性細胞主要位于血管旁，見圖2、圖3。RHD組 IL-17、IL-21、IL-6、IL23的表達陽性細胞比例及其乘積評分均明顯高于NRHD組(P<0.05)，見圖4。

圖1　兩組患者二尖瓣膜病理HE染色(×400)

圖2　兩組患者心瓣膜IL-17、IL-21免疫組化表達(DAB，×400)

圖3　兩組患者心瓣膜IL-6、IL-23免疫組化表達(DAB，×400)

與NRHD組比較：1)P<0.05圖4　兩組IL-17、IL-21、IL-6、IL23的表達

3討論

本文發現， Th17細胞自分泌的細胞因子IL-17和IL-21在人類慢性RHD瓣膜中的表達與對照組相比明顯增加，同時促進Th17細胞分化的正向調節因子IL-6和IL-23與對照組也存在差異。本研究證實所有患者風濕活動屬于慢性穩定期，表明該Th17細胞的表達不是由鏈球菌急性感染引起的，在慢性RHD疾病穩定期，Th17細胞造成的自身免疫損害占主要優勢。同時，在慢性RHD瓣膜中，Th17相關細胞因子在炎癥細胞上的表達為局灶性的分布，這與Guilherme等〔3〕的研究結果風濕性病變瓣膜組織有慢性炎癥和炎性細胞局灶浸潤相一致。

Wang等〔8〕的研究顯示，β鏈球菌感染誘導的組織生長因子(TGF)-β1和IL-6，有助于CD4+T細胞向Th17細胞系的發育。在他們的研究中，Th17細胞的免疫是被動轉移到裸鼠中去的，并且顯示對抗鏈球菌的保護性免疫依賴于Th17細胞系。我們的研究結果也證實，促進Th17細胞分化的正向調節因子IL-6、IL-23在瓣膜中表達明顯增加，可以認為 IL-6和IL-23表達升高可能促進了Th17細胞的分化。Th17細胞在對抗鏈球菌和導致自身免疫是必需的。最近，Bas等〔9〕報道，風濕性心臟病患者外周Th17細胞的百分比和血清中Th17/Treg的比例顯著升高。Guilherme等〔10〕通過分析來源于慢性RHD患者外周T細胞中的IL-17A基因表達，發現來源于RHD患者的外周T細胞表現出IL-17A過表達，他們還闡述發現大量的IL-17和IL-23存在于心瓣膜細胞中〔11〕。根據以上研究推測，在風濕性心臟病早期，易感個體中反復的鏈球菌暴露連同長期和過度的Th17反應可能引發心瓣膜炎，而在風濕性心臟病的晚期，Th17細胞介導的自身免疫作用持續加重了心臟瓣膜的損害。但這一假設還需要進一步的評估。

由于RHD病因復雜、影響因素較多以及動物模型建立困難等，目前并沒有特別的治療能夠有效防止RHD的進展。在全球范圍內，每3～4 w肌內注射芐星青霉素G(BPG)的二級預防仍被推薦〔12〕。然而，二級預防的效果是有限的，因為全球BPG的供應量和質量存在差異，且患者每3～4 w注射BPG的依從率較低〔13〕。因此，需要新的策略防止急性RF的復發以及RHD的進展。本研究也存在一定的局限性，僅僅使用免疫組化的方法檢測Th17部分相關細胞因子的表達，且只是研究了在RHD慢性期瓣膜的改變，未研究急性期瓣膜的改變，這也是我們將來研究的內容。

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11Guilherme L,Kalil J.Rheumatic heart disease:molecules involved in valve tissue inflammation leading to the autoimmune process and anti-S.pyogenes vaccine〔J〕.Front Immunol,2013;4:352.

12王健,全瑛,吉健華,等.TGF-β1通過抑制HIF-1α減少風濕性心臟病心肌細胞膠原合成〔J〕.現代生物醫學進展,2014；14(34):6634-6,6617.

13Remenyi B,Carapetis J,Wyber R,etal.Position statement of the World Heart Federation on the prevention and control of rheumatic heart disease〔J〕.Nat Rev Cardiol，2013;10(5):284-92.

〔2014-12-27修回〕

(編輯徐杰)

通訊作者：曾志羽(1965-)，男，教授，主要從事風濕性心臟病、冠心病方面的研究。

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81260067)；廣西科學研究與技術開發計劃項目(桂攻科1355005-4-4)

中圖分類號〔〕R593.21〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2016)01-0061-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.026