血小板衍化生長因子-D基因多態性與冠狀動脈粥樣斑塊的相關性

劉相飛　高　靜　陳玉東

(勝利油田中心醫院心內科，山東　東營　257034)

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血小板衍化生長因子-D基因多態性與冠狀動脈粥樣斑塊的相關性

劉相飛高靜陳玉東

(勝利油田中心醫院心內科，山東東營257034)

摘要〔〕目的探討血小板衍化生長因子(PDGF)-D rs7950273位點基因多態性與冠狀動脈粥樣硬化斑塊性質的相關性。方法237例冠心病(CHD)患者根據冠脈造影及血管內超聲檢查(IVUS)結果將粥樣斑塊分為穩定斑塊組(65例)、易損斑塊組(89例)、混合斑塊組(83例),采用聚合酶鏈反應(PCR)技術檢測PDGF-D rs7950273基因多態性及測序鑒定，并選擇112例正常者為對照。結果CHD組(62 例,26.2%)CC基因型頻率顯著高于對照組(16 例,14.2%),而對照組GG基因(39例,34.8%)高于CHD組(43例,18.1%)。CHD組C等位基因頻率(256例,54.1%)明顯高于對照組(89 例,39.7%)。CHD亞組間基因頻率分布特點為穩定斑塊組與易損斑塊組、混合斑塊組差異顯著(P<0.05)。結論PDGF-D rs7950273位點基因多態性與冠狀動脈粥樣硬化斑塊性質的相關,C 等位基因使易損斑塊的發生率增加。

關鍵詞〔〕冠狀動脈粥樣硬化斑塊;基因多態性;血小板衍化生長因子(PDGF)-D rs7950273

第一作者：劉相飛(1981-)，男，碩士，主要從事冠心病、心律失常介入治療研究。

血小板衍化生長因子(PDGF)是體內一種較強的促細胞增長調節因子，其分子量約為28～35 kD的陽離子糖蛋白，可由血小板、成纖維細胞、血管內皮細胞、單核巨噬細胞等多種細胞產生和釋放，與機體組織的新陳代謝、冠狀動脈粥樣硬化的發生發展密切相關。冠心病(CHD)發病機制極其復雜，而冠狀動脈粥樣硬化(AS)斑塊破裂和血栓成為導致主要心血管事件的病理基礎，而如何提前預測斑塊的性質已成為當前的研究熱點。近年來,PDGF-D在AS發生和斑塊穩定性中的作用日益引起醫學界的高度重視〔1〕。本研究將從分子生物學水平闡述PDGF-D rs7950273位點基因多態性是否與粥樣斑塊血管內超聲(IVUS)顯像特征相關。

1資料與方法

1.1一般資料2010年6月至2014年5月我院心內科住院并行冠脈造影+IVUS檢查的237例患者。依據冠脈造影+IVUS結果分組：①穩定斑塊組：65例，男43例，女22例，平均年齡(62.1±9.3)歲；②易損斑塊組：89例，男58例，女31例，平均年齡(62.9±10.3)歲；③混合斑塊組：83例，男57例，女26例，平均年齡(61.5±9.4)歲；另選取體檢健康者為對照組：112例，男75例，女37例，平均年齡(61.9±9.6)歲。四組年齡、性別、吸煙比例、高血壓比例、糖尿病比例、甘油三酯及膽固醇均無統計學差異(P>0.05)。見表1。根據病史及輔助檢查排除各種感染性疾病、腫瘤、結核、肝腎疾病、結締組織病、甲狀腺疾病、血液系統疾病、自身免疫性疾病、代謝性疾病等。

表1　各組一般資料及實驗室數據指標±s)

1.2方法①基因組DNA的提取。均于入院后抽取3 ml靜脈血，應用乙二胺四乙酸抗凝管，分離白細胞，應用低滲溶血法提取基因組DNA。②引物設計與合成。采用Oligo 6.0軟件設計引物，由中國奧科生物公司合成。PDGF-D rs7950273位點上游引物5'-GCCACATTTAGCCATTCT-3'；下游引物5'-TGTTGGGATGAAGAAAGG-3'。③基因型檢測。首先采用PCR方法擴增包含PDGF-D基因rs7950273位點的目的基因DNA片段。然后將PCR擴增產物應用限制性內切酶(BsmAⅠ)進行酶切，隨后應用 3.5%瓊脂糖凝膠檢測，最后應用凝膠成像儀拍照后確定基因型。將PCR擴增產物隨機抽取，委托深圳華大基因公司采用Sanger法進行基因測序。

1.3統計學方法應用SPSS17.0統計軟件進行t、χ2檢驗。

2結果

2.1PDGF-D rs7950273基因型檢測結果rs7950273位點PCR擴增產物出現3種基因型：CC基因型(320 bp 1條帶)，GG基因型(192、128 bp 2條帶)，雜合子CG基因型(320、192、128 bp 3條帶)，見圖1。基因測序結果與酶切結果完全一致。見圖2。

2.2基因多態性分布特點 PDGF-D rs7950273位點的等位基因頻率在CHD各亞組和對照組的分布特點均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P>0.05)。CHD組CC基因型頻率顯著高于對照組,而對照組GG基因高于CHD組。CHD組C 等位基因高于對照組(P<0.05)。穩定斑塊組與易損斑塊組、混合斑塊組差異顯著(P<0.05)，易損斑塊組與混合斑塊組差異不顯著(P>0.05)。見表2。

1、3為CC基因型；2、5為GG型；4、6為CG型；M.Marker圖1　酶切后3.5%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2　基因型測序圖

組別n等位基因頻率CG基因型頻率CCCGGGCHD組237256(54.1)1)218(45.9)1)62(26.2)1)132(55.7)1)43(18.1)1)穩定斑塊組6556(43.1)2)74(56.9)2)9(13.8)2)38(58.5)2)19(27.7)2)易損斑塊組89102(57.4)76(42.6)28(31.5)46(51.7)15(16.9)混合斑塊組8395(57.2)71(42.8)26(31.3)43(51.8)14(16.9)對照組11289(39.7)135(60.3)16(14.2)57(50.9)39(34.8)

與對照組比較：1)P<0.05；與易損斑塊組、混合斑塊組比較：2)P<0.05

3討論

PDGF是血管內皮生長因子家族成員之一，包括5中形式：PDGF-A、-B、-AB、-C、-D，其中D鏈基因位于11q22染色體上。CHD是由多個基因及環境因素相互作用所致的常見復雜性疾病。“常見疾病、多個易感基因、微效作用”理論提出個體的易感基因遺傳變異可能顯著增加CHD發病率。遺傳度大于20%的表型具有明顯的遺傳傾向，流行病學研究也證實CHD患者多數存在家族聚集性〔2〕。近年來，CHD遺傳學方面研究致力于尋找AS的遺傳致病/易感基因，確定這些致病/易感基因是否有利于確定干預靶點和早期危險識別。

在AS發生發展過程中，各種原因所致損傷的內皮細胞、血小板及激活的單核巨噬細胞都能以自分泌和旁分泌釋放PDGF，并在斑塊表面過度表達，而PDGF作為一種平滑肌細胞的趨化因子，除促進平滑肌細胞在AS發展過程中不斷積聚外，還可與相應的受體結合促進泡沫細胞形成，進一步促進細胞內脂質聚集和細胞外基質沉積〔3～5〕。AS斑塊可分為穩定斑塊和不穩定斑塊，后者又稱為易損斑塊。研究發現，人類的易損斑塊包括多種病理類型，其中最常見的病理性類型為富含炎癥的薄帽的纖維粥樣斑塊(TCFA)〔6〕，其主要特征包括大的脂質核(占斑塊面積的25%)、薄的纖維帽(<65 μm)，斑塊內富含巨噬細胞和T淋巴細胞、基質成分和平滑肌細胞減少和正性重構等〔7〕。近期有關易損斑塊動物模型與急性冠脈綜合征患者的研究〔8〕發現，炎癥免疫機制、增殖凋亡機制、損傷應激機制及生物力學機制參與了AS斑塊的發生、發展過程。IVUS可根據斑塊的回聲特點判斷其性質，目前IVUS導管系統可以產生灰階IVUS和虛擬組織學(VH)-IVUS。VH-IVUS將識別富含脂質壞死核的敏感性和特異性提高到91.7%和96.6%〔9〕。近期有關VH-IVUS的PROSPECT研究結果表明，通過VH-IVUS技術所確定的易損斑塊可以預測CHD患者主要心血管事件的發生率〔10,11〕。本研究提示C等位基因使得CHD的發生率明顯提高。PDGF-Drs7950273位點的基因多態性與易損斑塊直接相關，究其具體機制可能與C等位基因干預了PDGF-Drs7950273 蛋白翻譯效率,影響PDGF-D的表達有關。

綜上,PDGF-D基因的rs7950273的基因多態性與冠狀動脈粥樣斑塊的IVUS顯像特征密切相關。新近研究〔12〕表明Trapidil和鈣離子阻滯劑可分別通過抑制PDGF受體磷酸化和PDGF介導的血管平滑肌細胞增生阻止AS發生，減小內膜斑塊面積。隨著分子心臟病學的深入研究，相信從分子水平進行干預AS斑塊的治療策略將在未來實現。

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〔2014-12-09修回〕

(編輯苑云杰)

通訊作者：高靜(1979-)，女，博士，副教授，主要從事冠心病、高血壓研究。

基金項目：山東省醫藥衛生科技發展計劃項目(No.2011HW075)

中圖分類號〔〕R541〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2016)01-0073-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.031