體外精子發生條件研究進展

孫雯亮，云志中，馬玉珍.內蒙古醫科大學研究生學院，內蒙古呼和浩特　000；.內蒙古自治區人民醫院泌尿外科，內蒙古呼和浩特　0007；.內蒙古自治區人民醫院生殖中心，內蒙古呼和浩特　0007

體外精子發生條件研究進展

孫雯亮1，云志中2，馬玉珍3
1.內蒙古醫科大學研究生學院，內蒙古呼和浩特010110；2.內蒙古自治區人民醫院泌尿外科，內蒙古呼和浩特010017；3.內蒙古自治區人民醫院生殖中心，內蒙古呼和浩特010017

對體外精子發生進行研究，并構建相應的體外誘導環境，實現在體外環境中形成具有正常功能的精子，對于男科醫學領域具有重大科研價值和實際應用意義，同時也為生殖科學技術的發展與進步做出貢獻。然而在生物體內精子發生所需的條件十分復雜，并且至今對于精子發生的詳細機制尚不明確，從而使精子發生過程在體外條件下實現的難度極大。本文主要針對近年體外精子發生條件的研究進展做一綜述。

精子發生；體外誘導；培養條件

［Abstract］It has great value in scientific study and clinical practice that we do research in spermatogenesis ex vivo，establish the induction conditions and obtain the functional sperm in vitro，which would make contribution to the improvement of reproductive science.However，the conditions needed for spermatogenesis in vivo are so complicated that the detail mechanism of spermatogenesis has not been defined to date.Consequently，it is highly difficult to achieve spermatogenesis in vitro.In this review，the current state and recent advances in the research of the conditions for spermatogenesis in vitro will be reported.

［Key words］Spermatogenesis；In vitro induction；Culture conditions

在體外培養環境中完成精子發生過程為保存雄性生育力以及治療雄性不育都指明了新的方向，同時也為在可控的實驗條件下探究雄性生殖細胞的詳細分化過程提供了新的手段。距離科研人員首次嘗試探索精子發生過程并尋求建立體外精子發生的培養環境已有一個世紀，然而只取得了有限的進展。本文主要針對近年體外精子發生條件的研究進展做一綜述。

1　通過睪丸組織碎片的體外培養進行體外精子發生

對于雄性生殖細胞的體外培養與誘導分化的首次嘗試發生于1915年，Goldschmidt通過對睪丸組織碎片進行體外培養希望能夠在體外培養條件下維持完整的精子發生過程。1959年Trowell研發了一種氣-液界面器官/組織培養系統，并對成年鼠的睪丸組織進行了培養，在其研究過程中發現了組織培養過程中的一項重要問題，即組織缺氧。1964年Steinberger繼承了Trowell團隊前期發明的氣-液界面培養系統并進行了改進，同時將培養對象改為新生幼鼠的不成熟睪丸組織。在此項研究中發現了保證精子發生順利進行所需的另一個關鍵條件，即睪丸微環境的調節作用，同時還發現當向培養液中加入含有維生素A、E、C的血清后精原干細胞才開始分化為初始A型精原細胞。此研究在20世紀60年代進展迅速，這主要歸功于A.Steinberger與E.Steinberger兩位學者對器官培養系統所做的大量研究，他們選用幼鼠的不成熟睪丸組織成功地將精原細胞誘導分化至減數分裂粗線期。1983年Parvinen證實了Steinberger的研究中精子發生進程停滯在減數分裂粗線期的原因是當時的培養條件所限，但通過利用Steinberger的研究成果Boitani在1993年證實卵泡刺激素在A型精原細胞分化為精母細胞的過程中具有重要作用。而Steinberger的另一項研究開創性的界定了培養液pH介于6.8～7.0的培養條件有利于睪丸組織的體外培養，同時進一步嘗試將這種體外培養方法應用與人類的精子發生過程，Steinberge證實利用器官培養法可以將人類的睪丸細胞在體外培養數周，并使精母細胞從細線期分化至粗線期。此后陸續出現關于體外精子發生的報道，但結果都始終無法使精母細胞的分化進程突破粗線期，從而使此項研究的進展停滯數十年。

2010年Gohbara選用出生后4.5～14.5 d的Acr-GFP幼鼠［1］和Gsg2-GFP幼鼠［2］的睪丸，將睪丸切分成組織碎片后放置到分別浸泡在添加了胎牛血清，α-MEM，DMEM，StemPro-34SFM培養液中的瓊脂糖凝膠塊上進行培養。結果在顯微鏡下觀察到了精子細胞。

2011年Sato等［3-4］取得里程碑意義的突破，Sato團隊首先選用出生后0.5～11.5 d的Gsg2-GFP鼠和Acr-GFP鼠睪丸組織。根據標準氣-液界面培養法，將睪丸組織碎片放置到浸泡于培養液中的瓊脂糖凝膠塊上，培養液中添加血清替代物（Knockout serum replacement，KSR），結果KSR使GFP基因的表達程度明顯增強，GFP基因持續表達的時間顯著延長。通過對減數分裂標志蛋白SYCP1和SYCP3的檢測證實所培養的組織中發生了減數分裂，利用HE染色、PAS染色以及免疫熒光染色分別在立體顯微鏡和熒光顯微鏡下對所培養的睪丸組織進行組織學檢測，結果在7個受檢的組織樣本中有6個樣本中發現了大量精子細胞，另外11個受檢樣本中有5個樣本觀察到了生有鞭毛的精子。最后通過圓形精子細胞注射技術（round spermatid injection，ROSI）［5］和胞漿內精子注射技術（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）［6］分別對培養產生出的精子細胞與精子進行了生育能力的檢測，結果ROSI組產生出7個健康的子代鼠，ICSI組產生出5個健康的子代鼠。Sato團隊選用PCXN-GFP鼠［7］、Acr-GFP鼠、Gsg2-GFP鼠和Sl/Sld鼠這4種鼠的睪丸組織用于體外培養精原干細胞，ICR鼠和W/W v鼠被用作宿主，這兩種鼠的睪丸組織作為宿主睪丸接受體外培養出的精原干細胞進行注射移植。選用鼠胚胎成纖維細胞作為飼養層細胞進行體外培養精原干細胞，隨后將體外培養出的精原干細胞經由睪丸網注射入宿主鼠睪丸曲細精管內，隨后將宿主鼠睪丸取出，切分為組織碎片后放置到浸泡于培養液中的瓊脂糖凝膠塊上進行培養，結果發現了精子細胞和精子。最后將培養出的精子細胞和精子通過微受精技術注射到卵母細胞內，結果同樣成功產生出健康的后代鼠。

2013年Sato等［8］選用出生后7.5～10.5 d的Acr-GFP幼鼠和Gsg2-GFP幼鼠睪丸組織用于體外培養精原干細胞，W/W v鼠被用作宿主，選用JK1細胞作為飼養層細胞。再次運用2011年研究中的培養方法，結果也成功產生出健康的后代鼠。

2014年Yokonishi等［9］選用雄性Gsg2-GFP鼠和Acr-GFP鼠分別同雌性ICR鼠交配產生子代，將出生后0.5～5 d的子代幼鼠睪丸取出，分別通過緩慢冷凍法或玻璃化冷凍法進行冷凍后放入液氮中保存7～8 d，隨后取出解凍，解凍后將睪丸組織放置到浸泡于培養液中的瓊脂糖凝膠塊上進行培養。結果在30例睪丸組織樣本中有17例發現了精子，其中7例樣本各含有超過100條精子，6例樣本各含有超過10條精子。最后利用微授精技術使培養出的精子細胞與精子產生出了8個健康后代鼠，這些后代鼠之間雌雄交配后證實這8個后代鼠都具有生育能力，并且產生了子代鼠。

在Sato團隊之前的研究中開發了一種能使不成熟的幼鼠睪丸組織完成從精原干細胞到精子形成這一完整精子發生過程的體外培養方法［3，4，10］，但對于這種體外培養方法是否也適用于成年鼠的成熟睪丸組織有待證實，于是在2015年Sato等［11］選取成年Acr-GFP鼠、Gsg2-GFP鼠、缺乏維生素A模型鼠和Sl/Sld鼠，將四種成年鼠睪丸切分為組織碎片后放置在瓊脂糖凝膠塊上，浸泡于添加KSR或AlbuMAX的α-MEM培養液中進行培養。對于Sl/Sld鼠需要在培養液中額外添加鼠干細胞因子Kit配體和集落刺激因子-1。結果在四種成年鼠成熟睪丸組織的培養樣本中都發現了精子細胞，但產生出精子細胞的數目較少。從而說明器官培養法能夠誘導成年鼠的成熟睪丸組織完成從精原干細胞到精子形成這一完整的精子發生過程，但效率低于對新生鼠不成熟睪丸組織的誘導效率。

2　利用細胞懸液進行體外精子發生

將組織酶解后形成的細胞懸液進行培養，當前現代化的培養條件可提供良好的支持，但僅僅是細胞懸液無法提供精子發生所需的微環境，理想的培養體系中應具有類似生精微環境的培養條件。至今未能在體外條件下實現由人類的精原細胞形成成熟的精子，只有針對精子發生過程中的某一階段得以實現的報道。Cremades利用人的成纖維細胞作為飼養層將人的圓形精子細胞與成纖維細胞共培養，結果使圓形精子細胞分化為延長型精子細胞。Sousa將人的精原細胞與睪丸支持細胞在添加了卵泡刺激素和睪酮的培養基中共培養，使精原細胞進入了減數分裂。Tanaka將人的精母細胞與成纖維細胞在添加了卵泡刺激素和睪酮的培養基中共培養，使精母細胞分化成為精子細胞。

而對于鼠類的研究中Vigier研究表明當精母細胞與睪丸支持細胞共培養時卵泡刺激素和睪酮會使培養產生的圓形精子細胞數量增加。Iwanami研究發現將幼鼠的A型精原細胞與睪丸支持細胞共培養后可產生圓形精子細胞，但所產生的圓形精子細胞基因型異常，通過微授精注射后沒有產生出后代。

3　利用三維培養系統進行體外精子發生

隨著對器官培養和細胞培養研究的深入，科研人員發現睪丸細胞在培養環境中的空間條件對精子發生過程也可產生影響，由此產生了三維培養系統。與培養皿中的二維平面培養環境相比，三維培養環境更接近于睪丸內部的立體環境。Lee JH將出生后18 d的鼠生殖細胞與支持細胞、間質細胞置于膠原蛋白凝膠營造的三維培養環境中共培養，結果生殖細胞分化至減數分裂后期并且細胞的存活率良好。Stukenborg利用三維軟瓊脂培養環境通過添加人絨毛膜促性腺激素和卵泡刺激素使鼠的精原細胞完成了減數分裂并分化形成形態成熟的精子。Abu通過在三維軟瓊脂培養環境中增添胎牛血清也得到與Stukenborg相同的結果。

對于人類的雄性生殖細胞利用三維培養環境進行體外培養少見報道。Lee D.R的研究中將非梗阻性無精癥患者的生殖細胞置于藻酸鈣營造的三維培養環境中培養，結果發現了表達有減數分裂后期特異性基因的單倍體生殖細胞，但該細胞未發育為成熟的精子。Lee JH將非梗阻性無精癥病人的精母細胞與體細胞放置在由膠原蛋白凝膠營造的三維培養環境中共培養，結果產生出了單倍體精子細胞。

4　在微流體設備中進行體外精子發生

由于在體內睪丸組織周圍擁有豐富的毛細血管，毛細血管持續高效地為睪丸組織輸送氧氣與營養，同時帶走睪丸組織的代謝廢物，從而維持著睪丸內環境的穩定。而本文之前所述的三種培養方法都缺少與毛細血管類似的微循環系統，從而無法提供像體內一樣的培養環境。為克服這一缺陷，研究者們將循環體系引進他們的培養系統中，尤其是Rose團隊研發了名為環繞灌注系統的培養體系，在此培養系統中循環流動的培養液快速地從覆蓋著透析膜的培養組織表面流過，在此培養系統中多種器官在幾個月的培養過程中始終都保持著組織學特征。但是對于在此培養系統中所培養的器官組織的功能沒有進行檢驗與評估。

2016年Komeya等［12］設計了一種微流體設備，利用多孔膜將睪丸組織與持續流動的培養液分隔開，以此模擬體內微血管中的血流與微血管周圍組織之間的關系。在這個微流體設備中將出生后0.5～5.5 d的Acr-GFP幼鼠的睪丸組織中的精子發生過程維持了6個月，此過程中產生出的精子細胞和精子通過ROSI和ICSI產生出了健康的后代鼠。同時在利用此微流體設備對睪丸組織進行培養的過程中睪丸組織持續產生出睪酮，并對黃體生成素的刺激作出響應，產生睪酮的能力為每克睪丸組織每日產生睪酮2.4～24.0 μg，這一結果接近于處于體內環境中的睪丸。

這些結果表明這種微流體設備成功的營造出類似于體內的環境，使睪丸組織保持了生理功能和內環境的穩定，因此這種微流體設備為未來多種組織和器官培養條件的改善提供了有價值的基礎，并且可能使器官培養方法發生巨大變革。

5　結語

對于體外精子發生的研究至今仍處在有限的實驗階段，對于體外精子發生尚存有眾多未被解決的問題：對于精子發生的詳細機制還沒有明確；在當前的體外誘導條件下精子的產生效率還很低；體外培養所獲得的精子生物學活性不高。這些問題都為未來體外精子發生的研究指明了方向。希望隨著對體外精子發生研究的不斷深入，研究成果能早日應用于臨床，從而為輔助生殖提供新的選擇。

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Advances in the Study of the Conditions for Spermatogenesis in Vitro

SUN Wen-liang1，YUN Zhi-zhong2，MA Yu-zhen3
1.Inner Mongolia Medical University，Hohhot，Inner Mongolia，010110 China；2.Department of Urology，Inner Mongolia People’s Hospital，Hohhot，Inner Mongolia，010017 China；3.Center of Reproduction，Inner Mongolia People’s Hospital，Hohhot，Inner Mongolia，010017 China

R69

A

2096-1782（2016）07-0156-04

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.07.156

孫雯亮（1990.2-），男，黑龍江伊春人，碩士在讀，研究方向：泌尿系統疾病及男科疾病。

云志中（1963.9-），男，蒙古族，內蒙古呼和浩特人，本科，主任醫師，研究方向：泌尿系統疾病及男科疾病，E-mail：yzzyb168@126.com。