Toll樣受體4與心血管疾病的研究進(jìn)展

吳亞希　綜述　楊麗霞　審校

(成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院心內(nèi)科， 云南 昆明650032)

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Toll樣受體4與心血管疾病的研究進(jìn)展

吳亞希綜述楊麗霞審校

(成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院心內(nèi)科， 云南 昆明650032)

【摘要】Toll樣受體是一類表達(dá)于細(xì)胞膜上的受體家族，在先天性免疫和獲得性免疫系統(tǒng)中，起到識(shí)別微生物的作用。Toll樣受體4是最早發(fā)現(xiàn)的Toll樣受體，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、促進(jìn)免疫細(xì)胞成熟分化和參與促炎因子反應(yīng)中，都起到了重要作用。越來越多的研究證實(shí)，Toll樣受體4作為先天性免疫的一個(gè)重要介質(zhì)參與了心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。現(xiàn)主要對(duì)Toll樣受體4在心血管疾病中的研究進(jìn)展做一綜述。

【關(guān)鍵詞】Toll樣受體4；心血管疾病；炎癥反應(yīng)

近年來，心血管疾病已成為威脅人類健康的主要疾病之一，其發(fā)病率及病死率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)。越來越多的研究表明，炎癥反應(yīng)在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。而Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)能促進(jìn)細(xì)胞因子的合成與釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)[2]。Toll樣受體4 (TLR4)是TLRs家族的一員，其在識(shí)別脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)及介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到了重要作用。TLR4在部分心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中起到的作用也成為了當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

1TLRs家族

TLRs是一類病原分子識(shí)別受體，最早于1996年在研究果蠅胚胎發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)，稱為dToll。至今，在人體中已至少有11種TLRs被發(fā)現(xiàn)，統(tǒng)稱為TLRs家族，并分別命名為TLR1～10、14[3]。

1.1TLRs的結(jié)構(gòu)、分布及其配體

TLRs為Ⅰ型跨膜蛋白受體，其組成分為三個(gè)區(qū)，分別為胞內(nèi)區(qū)、胞外區(qū)和跨膜區(qū)。胞外區(qū)結(jié)構(gòu)由19～25個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)序列(leucine-rich repeat,LRR)XLXXLXLXX(X代表任何氨基酸，L為亮氨酸)組成，每個(gè)LRR含24～29個(gè)氨基酸，為β折疊-環(huán)-α螺旋的結(jié)構(gòu)，形成一個(gè)馬蹄形的結(jié)構(gòu)，其作用是識(shí)別不同的病原分子[4]；胞內(nèi)區(qū)與白介素-1(interleukin-1，IL-1)受體相似，故稱之為Toll/IL-1同源受體區(qū)(Toll/IL-1 receptor homologous region,TIR)，約為200個(gè)氨基酸大小，含3個(gè)保守盒，在信號(hào)傳導(dǎo)中起到重要作用[5]。

TLRs分布十分廣泛，但具有細(xì)胞分布特異性，如TLR1普遍表達(dá)于各類免疫細(xì)胞；TLR2、4、5的分布則是除B、T和NK細(xì)胞以外的免疫細(xì)胞；TLR3只特異分布于樹突細(xì)胞[6]。而對(duì)于分布位置，TLR1、2、4、5、6均分布于細(xì)胞表面，而TLR3、7、8、9則位于細(xì)胞內(nèi)。

TLRs配體根據(jù)其來源可分為：外源性配體和內(nèi)源性配體[7]。外源性配體的來源主要是病原微生物，而內(nèi)源性配體的來源則是宿主細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體應(yīng)激時(shí)或組織損傷時(shí)釋放。

1.2TLRs的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

TLRs識(shí)別配體后，可通過一系列的跨膜信號(hào)傳導(dǎo)，傳遞至胞內(nèi)的接頭分子——髓樣分化因子88(MyD88)、MyD88接頭樣蛋白(Mal)、TLRs相關(guān)的干擾素活化因子(TRIF)和TLRs相關(guān)的分子。TLRs信號(hào)傳導(dǎo)通路依據(jù)是否包含MyD88，可分為MyD88依賴性和非MyD88依賴性兩種信號(hào)傳導(dǎo)途徑[5]。其中，TLR1、2、6、7和9介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑為前者，而TLR3介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑只有非MyD88依賴性通路，TLR4則兩者均有[8]。

2TLR4

TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)TLRs[9]，是介導(dǎo)LPS應(yīng)答的最主要受體，因其作為先天性免疫的一個(gè)重要介質(zhì)參與了炎癥反應(yīng)、自身免疫、心血管疾病、腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，獲得了越來越多的關(guān)注。

2.1TLR4的結(jié)構(gòu)、分布和配體

作為TLRs家族中的一員，TLR4也同樣分為三個(gè)部分：胞外區(qū)由24個(gè)LRR組成，能夠特異識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)；胞內(nèi)區(qū)存在一段序列保守區(qū)，稱為TIR區(qū)，與IL-1受體的胞內(nèi)區(qū)具有同源性[9]，這一序列保守區(qū)是TLR4與下游信號(hào)調(diào)節(jié)分子相互作用的關(guān)鍵部位，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮了重要作用。

TLR4廣泛分布于各類與免疫相關(guān)的各類細(xì)胞，如單核巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，以骨髓單核細(xì)胞的表達(dá)尤其多。此外，還分布與人體內(nèi)其他組織細(xì)胞，如肝臟的Kupffer細(xì)胞、肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞，胰腺的巨噬細(xì)胞、腺泡細(xì)胞核胰腺形狀細(xì)胞等[10]。

TLR4結(jié)合的配體依據(jù)來源分為外源性配體和內(nèi)源性配體。TLR4的主要外源性配體為L(zhǎng)PS，其與LPS結(jié)合蛋白結(jié)合后，兩者繼續(xù)與CD14相互作用，由CD14將LPS轉(zhuǎn)運(yùn)并鎖定在由TLR4和髓樣分化蛋白-2構(gòu)成的受體復(fù)合物[11]。研究表明，LPS與髓樣分化蛋白-2結(jié)合后， TLR4細(xì)胞外LRR介導(dǎo)了TLR4的聚合，進(jìn)一步誘導(dǎo)TLR4的信號(hào)傳導(dǎo)[5]。這一過程又被稱為TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路細(xì)胞外傳遞。除LPS等外源性配體外，TLR4還可識(shí)別多種內(nèi)源性配體，如透明質(zhì)酸、纖維蛋白素原、熱休克蛋白等[12]。

2.2TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

TLR4識(shí)別配體后，可以通過MyD88依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和MyD88非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，介導(dǎo)核因子-κB(nuclear factor-kappaB, NF-κB)活化和致炎細(xì)胞因子產(chǎn)生。

2.2.1MyD88依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

在此信號(hào)通路中，MyD88起到關(guān)鍵作用，其C端有一個(gè)TIR結(jié)構(gòu)域，而N端具有一個(gè)與腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor,TNFR)胞內(nèi)區(qū)相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域(DD)[13]。MyD88分別通過TIR結(jié)構(gòu)域與TLR4、DD結(jié)構(gòu)域與IL-1受體相關(guān)激酶(IL-1R-associated kinases，IRAKs)發(fā)生關(guān)聯(lián)，除此之外，TLR4招募MyD88后，兩者通過DD結(jié)構(gòu)域和TIR形成同源二聚體。由此可知，MyD88的功能是連接TLR4及其下游信號(hào)分子的轉(zhuǎn)接蛋白[14]。活化的MyD88可被IRAKs磷酸化，進(jìn)一步激活TNFR相關(guān)因子6(TNF receptor-associated factor 6，TRAF6)。活化后的TRAF6通過轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β活化激酶(TGF-β activated kinase，TAK1)與I-κB激酶(I-κB kinase,IKK)信號(hào)級(jí)聯(lián)，使NF-κB的抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,I-κB)磷酸化而降解，進(jìn)一步使轉(zhuǎn)錄因子NF-κB遷移至細(xì)胞核內(nèi)，引起炎癥相關(guān)基因如腫瘤壞死因子-α及IL-1、6、8、12等的轉(zhuǎn)錄[15]。

2.2.2MyD88非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

TLR4激活的MyD88非依賴性信號(hào)通路被稱為TRIF依賴性信號(hào)通路[16]。不同于MyD88依賴性信號(hào)通路，TLR4通過TRIF相關(guān)的接頭分子進(jìn)行間接招募TRIF，后者通過TNFR相關(guān)因子3(TNF receptor-associated factor 3，TRAF3)激活干擾素調(diào)節(jié)因子3的磷酸化同時(shí)誘導(dǎo)其核異位，激活后的干擾素調(diào)節(jié)因子3繼續(xù)誘導(dǎo)1型干擾素的表達(dá)，進(jìn)而促使各型干擾素的基因表達(dá)；在另一方面，TRIF結(jié)合TRAF6與受體相互作用蛋白1(receptor-interacting protein-1，RIP1)，進(jìn)一步激活TAK1，通過與MyD88依賴途徑類似的途徑激活NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路，最終同樣促使炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，引起炎癥反應(yīng)[17]。

3TLR4與動(dòng)脈粥樣硬化

動(dòng)脈粥樣硬化是一類炎癥性疾病，由于血液中高濃度的低密度脂蛋白對(duì)血管內(nèi)膜進(jìn)行攻擊，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，激發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)，從而形成粥樣斑塊，導(dǎo)致動(dòng)脈硬化[18]。炎癥反應(yīng)是影響斑塊穩(wěn)定性的重要機(jī)制。越來越多的證據(jù)證明，TLR4在動(dòng)脈粥樣硬化中作為先天性免疫的一個(gè)重要介質(zhì)而參與其中。TLR4通過激活NF-κB信號(hào)通路及相關(guān)促炎蛋白，促進(jìn)了炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定性。人類動(dòng)脈粥樣硬化斑塊表面高度表達(dá)TLR1、TLR2、TLR4及激活的NF-κB,TLRs表達(dá)水平的增加引起細(xì)胞激活和促炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活[19]。在Michelsen等[20]研究中，發(fā)現(xiàn)了TLRs的MyD88依賴性信號(hào)通路在動(dòng)脈粥樣斑塊的形成過程中扮演了重要角色，敲除MyD88基因的載脂蛋白 E(apolipoprotein E, apoE)敲除小鼠，盡管其仍有高膽固醇血癥，但其血管內(nèi)斑塊體積縮小、脂質(zhì)含量減少，同時(shí)，趨化因子、前炎癥因子和致炎基因的表達(dá)均明顯減少。除此之外，他們還證明了敲除TLR4基因后，apoE小鼠體內(nèi)斑塊體積、斑塊脂質(zhì)含量以及斑塊中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)也同樣減少。Chávez-Sánchez等[21]發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞經(jīng)氧化性低密度脂蛋白誘導(dǎo)，分化為泡沫細(xì)胞的這一過程中，TLR4和CD36發(fā)揮了關(guān)鍵作用，有助于泡沫細(xì)胞分化。Cole等[22]在動(dòng)物模型研究中指出，輕度修飾的低密度脂蛋白作為可激活TLR4信號(hào)途徑的內(nèi)源性配體，是一種強(qiáng)烈誘導(dǎo)劑，可使趨化因子和促炎因子分泌更加旺盛，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化，加速病變的發(fā)展。Lu等[23]研究通過使用 TLR4 拮抗劑球形紅桿菌LPS作用于糖尿病apoE 缺陷小鼠和非糖尿病 apoE 缺陷小鼠，發(fā)現(xiàn)TLR4 拮抗劑可以抑制糖尿病 apoE 缺陷小鼠血管炎癥及動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展，同時(shí)可降低非糖尿病 apoE 缺陷小鼠血清膽固醇及三酰甘油水平。在Yonekawa等[24]的研究中發(fā)現(xiàn)，TLR4在破裂斑塊中的含量遠(yuǎn)高于外周血，并且在單核細(xì)胞浸潤(rùn)的過程中起到了重要作用。Katsargyris等[25]學(xué)者對(duì)服用了他汀類降脂藥物的患者其體內(nèi)的頸動(dòng)脈粥樣斑塊進(jìn)行檢測(cè)， 發(fā)現(xiàn)未服藥患者體內(nèi)TLR4的表達(dá)水平明顯高于服藥患者，進(jìn)而得出粥樣斑塊的穩(wěn)定性可能與TLR4表達(dá)量相關(guān)的結(jié)論。這些都說明了TLRs不僅可以調(diào)控對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)展過程，而且還可以對(duì)其危險(xiǎn)因素產(chǎn)生影響。

4TLR4與高血壓

有研究顯示，高血壓是一種低度炎癥性疾病，而TLR4在高血壓的發(fā)生、發(fā)展過程中也發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[1, 26]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)在高血壓的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，而血管緊張素Ⅱ(angiotensin，AngⅡ)是主要的作用因子，AngⅡ本身不僅是一種促炎癥介質(zhì)，還可作為一種內(nèi)在的氧化劑，促使氧化應(yīng)激的發(fā)生。Ji等[27]發(fā)現(xiàn)AngⅡ的促炎性反應(yīng)作用是通過TLR4，經(jīng)由AT1/ERK1/2/TLR4/IP-10/PKC/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的。Eissler 等[26]研究學(xué)者采用 WKY大鼠，用NG-硝基-左旋精氨酸甲酯誘導(dǎo)其產(chǎn)生高血壓后，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的WKY大鼠其心臟組織中的TLR4表達(dá)量明顯升高。同樣，在Bomfim等[28]的研究中發(fā)現(xiàn)，用美國(guó)維斯塔爾(Wistar)大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)，SHR大鼠其血壓升高及炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生原因均與TLR4有關(guān)，抑制TLR4后，可在一定程度上降低血壓，減輕炎癥反應(yīng)。盧文等[29]研究顯示，高血壓腎損害和單純高血壓患者外周靜脈血中單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞TLR4表達(dá)升高，由此推測(cè)，在AngⅡ的作用下使TLR4高表達(dá)，可以加強(qiáng)單核細(xì)胞的吞噬功能和中性粒細(xì)胞的趨化，促進(jìn)高血壓炎癥反應(yīng)。陳思等[30]研究結(jié)果表明高血壓患者TLR4陽(yáng)性率顯著高于正常人群，以上都表明了TLR4與高血壓病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

5展望

綜上所述，TLR4作為一個(gè)重要的炎性受體，越來越多的證據(jù)表明其與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。隨著對(duì)TLR4研究的深入，其在心血管疾病的預(yù)防、診斷、治療等臨床應(yīng)用將會(huì)有良好的應(yīng)用前景，其是否可以成為心血管疾病新的治療靶點(diǎn)，值得研究者們做進(jìn)一步的探究。

[ 參 考 文 獻(xiàn) ]

[1]Badr K, Wainwright CL. Inflammation in the cardiovascular system:here,there and everywhere[J]. Curr Opin Pharmacol,2004,4(2):107-109.

[2]Akira S, Uematsu S, Takeuchi O. Pathogen recognition and innate immunity[J]. Cell, 2006,124(4):783-801.

[3]Lin Y, Verma A, Hodgkinson CP. Toll-like receptors and human disease:lessons from single nucleotide polymorphisms[J]. Curr Genomics,2012,13(8):633-645.

[4]Wang Y, Ge P, Zhu Y. TLR2 and TLR4 in the brain injury caused by cerebral ischemia and reperfusion[J]. Mediators Inflamm,2013,2013:124614.

[5]Akira S, Takeda K. Toll-like receptor signalling[J]. Nat Rev Immunol,2004,4(7):499-511.

[6]Muzio M, Bosisio D, Polentarutti N, et al. Differential expression and regulation of toll-like receptors(TLR) in human leukocytes:selective expression of TLR3 in dendritic cells[J]. J Immunol,2000,164(11):5998-6004.

[7]Cole JE, Georgiou E, Monaco C. The expression and functions of toll-like receptors in atherosclerosis[J]. Mediators Inflamm,2010,2010:393946.

[8]Yamamoto M, Akira S. Mechanisms of innate immune responses mediated by Toll-like receptors[J]. Clin Appl Immunol Rev,2005,5(3):167-183.

[9]Park BS, Lee J. Recognition of lipopolysaccharide pattern by TLR4 complexes[J]. Exp Mol Med, 2013,45:e66. doi: 10.1038/emm.2013.97.

[10]朱杰,樸榮利,高潤(rùn)平.TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路與胰腺炎[J].世界華人消化雜志,2012,(4):271-275.

[11]P?lsson-McDermott EM, O'Neill LA. Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor, Toll-like receptor-4[J]. Immunology, 2004,113(2):153-162.

[12]Lucas K, Maes M. Role of the Toll like receptor(TLR) radical cycle in chronic inflammation:possible treatments targeting the TLR4 pathway[J]. Mol Neurobiol, 2013,48(1):190-204.

[13]Liu N, Montgomery RR, Barthold SW, et al. Myeloid differentiation antigen 88 deficiency impairs pathogen clearance but does not alter inflammation in Borrelia burgdorferi-infected mice[J]. Infect Immun,2004,72(6):3195-3203.

[14]Downes CE, Crack PJ. Neural injury following stroke:are Toll-like receptors the link between the immune system and the CNS?[J]. Br J Pharmacol,2010,160(8):1872-1888.

[15]Wang Y, Lin S, Yang Q. Toll-like receptors in cerebral ischemic inflammatory injury[J]. J Neuroinflammation,2011,8(134):554-561.

[16]Hoebe K, Du X, Georgel P, et al. Identification of Lps2 as a key transducer of MyD88-independent TIR signalling[J]. Nature,2003,424(6950):743-748.

[17]Wu D, Lee YG, Liu H, et al. Identification of TLR downstream pathways in stroke patients[J]. Clin Biochem,2013,46(12):1058-1064.

[18]Tuttolomondo A, di Raimondo D, Pecoraro R, et al. Atherosclerosis as an inflammatory disease[J]. Curr Pharm Des,2012,18(28):4266-4288.

[19]Chang ZL. Important aspects of Toll-like receptors, ligands and their signaling pathways[J]. Inflamm Res,2010,59(10):791-808.

[20]Michelsen KS, Wong MH, Shah PK, et al. Lack of Toll-like receptor 4 or myeloid differentiation factor 88 reduces atherosclerosis and alters plaque phenotype in mice deficient in apolipoprotein E[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(29):10679-10684.

[21]Chávez-Sánchez L, Garza-Reyes MG, Espinosa-Luna JE, et al. The role of TLR2, TLR4 and CD36 in macrophage activation and foam cell formation in response to oxLDL in humans[J]. Hum Immunol,2014,75(4):322-329.

[22]Cole JE, Mitra AT, Monaco C. Treating atherosclerosis:the potential of Toll-like receptors as therapeutic targets[J]. Expert Rev Cardiovasc Ther,2010,8(11):1619-1635.

[23]Lu Z, Zhang X, Li Y, et al. TLR4 antagonist reduces early-stage atherosclerosis in diabetic apolipoprotein E-deficient mice[J]. J Endocrinol,2013,216(1):61-71.

[24]Yonekawa K, Neidhart M, Altwegg LA, et al. Myeloid related proteins activate Toll-like receptor 4 in human acute coronary syndromes[J]. Atherosclerosis,2011,218(2):486-492.

[25]Katsargyris A, Klonaris C, Tsiodras S, et al. Statin treatment is associated with reduced toll-like receptor 4 immunohistochemical expression on carotid atherosclerotic plaques:a novel effect of statins[J]. Vascular,2011,19(6):320-326.

[26]Eissler R, Schmaderer C, Rusai K, et al. Hypertension augments cardiac Toll-like receptor 4 expression and activity[J]. Hypertens Res,2011,34(5):551-558.

[27]Ji Y, Liu J, Wang Z, et al. Angiotensin Ⅱ induces inflammatory response partly via toll-like receptor 4-dependent signaling pathway in vascular smooth muscle cells[J]. Cell Physiol Biochem,2009,23(4-6):265-276.

[28]Bomfim GF, Dos Santos RA, Oliveira MA, et al. Toll-like receptor 4 contributes to blood pressure regulation and vascular contraction in spontaneously hypertensive rats[J].Clin Sci (Lond),2012,122(11):535-543.

[29]盧文,劉淑華,趙志明,等.高血壓患者TLR4和胱抑素C的水平變化及作用[J].臨床腎臟病雜志,2013,13(11):500-505.

[30]陳思,周忠,景勝.高血壓病患者外周血Toll樣受體-4及細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4 的表達(dá)及臨床意義[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2014,30(22):3601-3603.

Research Progress of Relationship Between Toll-like Receptor 4 and Cardiovascular Disease

WU Yaxi,YANG Lixia

(DepartmentofCardiology,KunmingGeneralHospitalofChengduMilitaryArea,Kunming650032,Yunnan,China)

【Abstract】Toll-like receptors(TLRs),a receptor family that express on the cell membrane, relates to the immune system that recognizes microorganisms and plays a highly important role in the activation of the innate and acquired immune system. As the first discovered TLRs,TLR4 participate in pro-inflammatory response, promote the immune cells maturity and regulate the immune response. A growing body of research suggests that TLR4 is an important medium of the innate immune is involved in the occurrence and development of cardiovascular disease. This article reviews the current research on the relationship between TLR4 and cardiovascular disease.

【Key words】Toll-like receptors;Toll-like receptor 4;Cardiovascular disease

收稿日期：2015-07-08修回日期：2015-10-27

【中圖分類號(hào)】R54

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2016.01.015

作者簡(jiǎn)介：吳亞希(1990—)，在讀碩士，主要從事動(dòng)脈粥樣硬化研究。Email：wuyaxi015@163.com通信作者：楊麗霞, Email:doctorlixia@aliyun.com