基于1H NMR 技術對COPD急性加重期血清特征性代謝物的研究

楊秀云 黃飛華 吳美倩 張永建 王曉平 楊中良?

基于1H NMR 技術對COPD急性加重期血清特征性代謝物的研究

楊秀云 黃飛華 吳美倩 張永建 王曉平 楊中良?

目的 采用1H 核磁共振（1H NMR）代謝組學技術研究慢性阻塞性肺疾?。–OPD）急性加重期血清的特征性代謝物。方法 31例COPD急性加重期患者（急性加重組）入院后24h內及經(jīng)過常規(guī)治療進入穩(wěn)定期（穩(wěn)定組）后各采集空腹靜脈血2 ml，離心取血清置-80℃冰箱保存，應用高分辨率1H NMR技術檢測得到兩組患者血清的一維氫譜圖，采用SIMCA-P+軟件對氫譜圖進行分段積分后的積分值進行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）以判別兩組血清代謝物有無差異。采用正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）判斷差異性代謝成分。結果 PCA和PLS-DA分析提示兩組血清代謝物及其積分值存在部分交叉，但仍存在一定的差異，ROC分析提示模型較為可靠。OPLS-DA分析提示，與穩(wěn)定組比較，急性加重組血清3-羥基丁酸、賴氨酸、谷氨酸、谷氨酰氨和丙酮酸水平明顯升高，而纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、極低密度脂蛋白（VLDL）和低密度脂蛋白（LDL）水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。說明COPD急性加重期存在嚴重的能量、蛋白質及脂類代謝紊亂。結論 COPD急性加重與能量、蛋白質及脂類代謝紊亂有關。由于納入研究的樣本量有限，本研究結果尚需大樣本研究證實。

慢性阻塞性肺疾病 急性加重 特征性代謝物1H 核磁共振 代謝組學

慢性阻塞性肺疾病（COPD）在我國患病率占＞40歲人群的8.2%，病死率高，已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題［1-2］。COPD是世界人口致殘和死亡的主要原因之一［2-3］。COPD患者頻繁的急性發(fā)作可導致肺功能下降［1］，最終引起生活質量的下降和生存壽命的縮短。急性加重最常見的原因為氣管支氣管樹的感染和空氣污染，但是約有1/3的嚴重急性加重期患者原因不明確［4］。本研究采用基于1H 核磁共振（1H nuclear magnetic resonance，1H NMR）代謝組學技術，篩選COPD急性加重期患者血清的特征性代謝物，從代謝水平探索COPD急性加重的形成機制，為COPD急性加重的防治提供新思路和新策略。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2013年1月至2014年12月期間浙江省立同德醫(yī)院呼吸內科住院患者31例，均符合COPD急性加重診斷標準［1］，屬于肺功能Ⅲ級的患者。本研究未對運動和飲食情況進行評估，為減少飲食對研究的影響，所有受試者禁食后于次日清晨采集靜脈血。納入標準：COPD急性加重期病例，肺功能Ⅲ級，即第1秒用力呼氣量（FEV1）占預計值百分比30%～49.9%，F(xiàn)EV1/FVC＜70%；年齡40～75歲；經(jīng)檢查血、尿常規(guī)、肝腎功能、血糖及血脂正常；心電圖無明顯異常，X線胸片示慢性支氣管炎、肺氣腫。排除標準：合并有結核、真菌感染、腫瘤及其他肺部原發(fā)性疾病者，合并心功能不全、肺性腦病等危重疾病者；合并心血管、泌尿、消化、造血、內分泌、代謝系統(tǒng)等嚴重疾病者；精神性疾病不配合者；妊娠或哺乳期婦女。本項目得到本院倫理委員會批準，并獲患者知情同意書。

1.2 分組 急性加重組：即COPD急性加重期患者31例，其中男15例，女16例；年齡51～81歲，平均（70.1±10.5）歲。吸煙者15例；FEV1占預計值（39.5±12.3）%，F(xiàn)EV1/FVC為（55.2±19.7）%。其中合并高血壓Ⅰ級3例，合并冠心病2例。根據(jù)病情給予化痰［沐舒坦，上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司，規(guī)格100ml（0.6g）］，口服，10ml/次，2次/d、解痙平喘（信必可都保吸入劑，SE-151 85 Sodertalje，Sweden，規(guī)格80μg，4.5μg/吸，1～2吸/次，2次/d）及控制性氧療（2L/min鼻導管吸入，12～15h/d）等常規(guī)治療。急性加重期患者并予相應的抗菌素、全身激素及局部霧化等治療。穩(wěn)定組：經(jīng)上述治療進入穩(wěn)定期后，即為穩(wěn)定組。

1.3 標本的采集和制備 急性加重組患者入院＜24h及穩(wěn)定組患者分別于清晨空腹采集靜脈血2ml，3000r/ min，離心10min，分離血清密封后置-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 代謝物的檢測和分析 （1）檢測儀器和樣本的處理：核磁管，美國norell公司；重水（Deuterium oxide/ D2O），美國CIL公司。離心機（Centrifuge 5415D），德國Eppendorf公司；液體快速混合器（YKA），江西醫(yī)療器械廠；Agilent NMR System 600MHz DD2譜儀，美國Agilent公司；軟件：SIMCA-11.0，瑞典Umetrics公司；MestReNova軟件（V7.0），西班牙Mestrelab。樣品的處理委托上海阿趣生物科技有限公司完成。充分混勻解凍的血清樣品后，取200μl血清與重水配制的400μl磷酸鹽緩沖液充分混勻。然后，4℃，12000 rpm離心10min，取上清液550 μl加入核磁樣品管（Norell，ST500-7）。（2）核磁共振氫譜的測試：在高分辨核磁共振譜儀（Agilent 600 DD2，USA）上進行NMR檢測，1H 頻率為600.11MHz，配備三共振高分辨探頭，采樣溫度為298K，采樣次數(shù)為64次，譜寬20ppm。每個樣品采樣前控溫≥5min，每個樣品的90°脈沖寬度調整為10μs左右，等待時間（Recycle delay，RD）為2s（期間進行預飽和壓水）。每個樣品進行預飽和壓水峰的CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）（RD -90°-（τ-180°-τ）n-ACQ）實驗，總的自旋-自旋回波時間（2nτ）為200ms，在弛豫延遲期間進行預飽和壓水。獲得一維核磁共振氫譜圖。（3）數(shù)據(jù)處理及分析：采用MestReNova軟件（V7.0）對氫譜圖進行傅里葉變換，手動相位調整、基線校正和譜峰對齊，血清氫譜圖以乳酸在1.33ppm處的雙峰定標，積分區(qū)間為9.5～0.7ppm，積分間距為0.002ppm，去掉6.0～5.5ppm處的尿素峰，5.214～4.450ppm包含殘余的水峰及其影響的鄰近的譜峰。采用SIMCA-P+（V11.0，Umetrics AB，Umea，Sweden）軟件將歸一化后的積分數(shù)據(jù)利用主成分分析法（PCA）進行分析，得到PCA得分圖。使用SIMCA-P+軟件對歸一化后的數(shù)據(jù)進行偏最小二乘法判別分析（PLS-DA），發(fā)現(xiàn)NMR數(shù)據(jù)（X變量）和其它變量（Y變量，分組信息）之間的相關性。PLS-DA使用自適換算（unit variance scaling）的數(shù)據(jù)標度換算方式。PLS-DA對模型的質量用交叉驗證法進行檢驗，并用交叉驗證后得到的 R2X（模型累優(yōu)化程度）、R2Y（反應變量Y的變異百分率）和 Q2（模型累積預測度）對模型有效性進行評判，采用受試者操作曲線（ROC）檢驗模型的可靠性。（4）特征性代謝物的發(fā)現(xiàn)和鑒定：對PLS-DA模型進行正交矯正處理（OPLS-DA），最大化凸顯組間的差異。通過自由度和P=0.05水平時差異顯著性確定代謝物相關系數(shù)│r│的界值，│r│值越大表示差異性越大，r為正值或負值的代謝物是在患者血清中降低或增加的代謝物。

圖1 兩組血清1H NMR氫譜圖（a． 急性加重組 b． 穩(wěn)定組）。注：1-MH：甲基組氨酸；3-HB：3-羥基丁酸；Ace：乙酸；Acet：丙酮；Ala：丙氨酸；Asn：天冬酰氨；Cho：膽堿；Cit：檸檬酸；Cr：肌酐；DMG：二甲基甘氨酸；For：甲酸；G：丙三醇；Glc：葡萄糖；Gln：谷氨酰氨；Glu：谷氨酸；Gly：甘氨酸；GPC：甘油磷酸膽堿；HX：次黃嘌呤；Ile：異亮氨酸；L1：低密度脂蛋白（LDL），CH3-（CH2）n-；L2：極低密度脂蛋白（VLDL），CH3-（CH2）n-；L3：LDL，CH3-（CH2）n-；L4：VLDL，CH3-（CH2）n-；L5：VLDL，-CH2-CH2-C=O；L6：脂類6，-CH2-CH=CH-；L7：脂類7，-CH2-C=O；L8：脂類8，=CH-CH2-CH=；L9：脂類9，-CH=CH-；Lac：乳酸；Leu：亮氨酸；Lys：賴氨酸；NAG：N-乙酰糖蛋白信號；OAG：O-乙酰糖蛋白信號；PC：磷酸膽堿；Phe：苯丙氨酸；Pyr：丙酮酸；Tyr：酪氨酸；Val：纈氨酸。

2 結果

2.1 COPD急性加重期與穩(wěn)定期血清1H NMR氫譜圖 COPD急性加重組與穩(wěn)定組血清樣本中具有代表性的代謝物1H NMR氫譜圖、譜峰、化學位移及信號強度分析結果，見圖1。其中化學位移δ5.4～9.0（虛線框內）區(qū)域比δ0.7～5.4區(qū)域放大16倍以清晰顯示。

2.2 主成分（PCA）分析 急性加重組與穩(wěn)定組主成分積分值集中分布于橢圓形散點圖（95%置信區(qū)間）的2、3象限和1、3、4象限，雖存在部分交叉，但兩組間仍存在一定的差異。見圖2。

圖2 兩組血清1H NMR氫譜圖數(shù)據(jù)的PCA得分圖（a．急性加重組 b．穩(wěn)定組）

2.3 PLS-DA分析及對模型的驗證 PLS-DA對模型質量進行檢驗及對模型有效性進行評判，急性加重組與穩(wěn)定組血清樣本中具有代表性的代謝物雖有部分交叉，但差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），模型ROC檢驗結果AUC=0.916，表示模型比較可靠。

2.4 OPLS-DA 急性加重期和穩(wěn)定期血清代謝物雖存在部分交叉，但前者以第二、三象限為主，后者以第一、二象限為主，差異有統(tǒng)計學意義。

2.5 COPD急性加重相關特征性代謝物的篩選 與對照組比較，急性加重組血清3-羥基丁酸、賴氨酸、谷氨酸、谷氨酰氨和丙酮酸水平等明顯升高，而纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脂類VLDL、脂類LDL及脂類9水平明顯下降（P＜0.05）。

3 討論

代謝組學是繼基因組學、轉錄組學、蛋白質組學后的一種系統(tǒng)生物學［5］。通過考察生物機體受刺激或擾動后代謝產(chǎn)物的變化，揭示機體生命代謝活動本質的科學，有利于指導疾病的防治。目前最常用的分析手段包括：1H核磁共振（1H NMR）、氣相色譜和質譜聯(lián)用（GC/MS），液相色譜和質譜聯(lián)用（LC/MS）及傅里葉變換紅外光譜與質譜聯(lián)用（FTIR/MS）等［6］。目前，代謝組學已開始用于某些慢性氣道疾病的研究，如囊性肺纖維化病、哮喘及氣道生物膜的研究［7］，有助于對疾病嚴重程度及細菌生物膜的鑒別。但是，至今尚未見 COPD急性加重相關的代謝組學研究報道。

本研究對 COPD 急性加重和穩(wěn)定期血清的1H NMR譜圖及模式識別分析，結果顯示，COPD急性加重期與穩(wěn)定期血清樣本之間存在顯著的特征性差異代謝物。急性加重期血清3-羥基丁酸、賴氨酸、谷氨酸、谷氨酰氨和丙酮酸水平等明顯升高，而纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、VLDL及LDL等脂類水平明顯下降。

急性加重組血清3-羥基丁酸和丙酮酸等水平明顯升高，說明存在明顯的能量代謝紊亂。3-羥基丁酸是人體脂肪酸代謝后產(chǎn)生的3種酮體之一，通常人體血液和組織中濃度約0.1mmol/L，在葡萄糖饑餓情況下可以作為腦部的一種應急性能源使用，3-羥基丁酸與體內能量代謝紊亂等有著密切聯(lián)系。丙酮酸為整個生物體基本代謝的中間產(chǎn)物之一，可通過乙酰輔酶A和三羧酸循環(huán)實現(xiàn)體內糖、脂肪和氨基酸間的互相轉化，在三大營養(yǎng)物質的代謝聯(lián)系中起著重要的樞紐作用。

急性加重組血清谷氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺水平升高，纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸水平顯著下降，說明COPD急性加重期蛋白質代謝紊亂。亮氨酸，異亮氨酸和纈氨酸三種支鏈氨基酸均為必需氨基酸，可以有效防止肌肉損失，因為其能夠更快地分解轉化為葡萄糖，給身體組織提供能量，有助于調節(jié)血糖水平。這三種氨基酸水平下降說明攝入減少，引起呼吸肌功能下降，促進誘發(fā)COPD急性加重的發(fā)作。另外，急性加重組血清VLDL和LDL等脂類水平明顯下降，說明COPD急性加重患者體內存在明顯的脂類代謝異常。

［1］ 中華醫(yī)學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組．慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)．中華結核和呼吸雜志,2013, 36(4): 255-264．

［2］ Global strategy for the diagnosis, management and prevention of chronic obstructive pulmonary disease(updated 2013)［EB/ OL］．http://www．goldcopd．org/guidelines-global-strategyfor=diagnosis-management．html．

［3］ Vestbo J, Hurd SS, Agustí AG, et al． Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD Executive Summary．Am J Respir Crit Care Med, 2013, 187(4):347-365．

［4］ Stanciole AE, Ortegón M, Chisholm D, et al． Cost effectiveness of strategies to combat chronic obstructive pulmonary disease and asthma in sub-Saharan Africa and South East Asia: mathematical modelling study．BMJ, 2012, 344:e608．

［5］ Nicholson JK, Lindon JC．Systems biology: metabonomics．Nature, 2008, 455(7216):1054-1056．

［6］ Koek MM, Jellema RH, van der Greef J, et al． Quantitative metabolomics based on gas chromatography mass spectrometry: status and perspectives．Metabolomics, 2011, 7(3): 307-328．

［7］ Robroeks CM, Berkel JJ, Dallinga JW, et al． Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls．Pediatric Research, 2010, 68(1):75-80．

Objective To explore the serum characteristic metabolites in acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease（COPD）by using of1H nuclear magnetic resonance（1H NMR）based metabonomics. Methods 31 COPD in-patients with acute exacerbation were included in this study. Fasting blood samples were taken from COPD patients with acute exacerbation within 24 hours after admission（acute exacerbation group）and after their entrance to stable stage after routine treatment（stable stage group），respectively. Serum samples were stored in -80℃ refrigerator after blood centrifugation. One-dimensional hydrogen proton spectra of serum samples from two groups were measured by using highresolution1H NMR，and the score values of which were analyzed by principal component analysis（PCA）and partial least square-discriminant analysis（PLS-DA）by using SIMCA-P+ software，in order to identify if there is difference in the serum metabolites between two groups. Then orthogonal partial least square-discriminant analysis（OPLS-DA）was used to judge the characteristic metabolite components between two groups. Results PCA and PLS-DA showed that there were differences between serum metabolites and associated scores between two groups，despite partial crossover，receiver operating characteristic curve analysis showed that model was reliable. OPLS-DA indicated that the serum levels of 3-hydroxybutyrate，lysine，glutamate，glutamine and pyruvic acid were significantly increased（P＜0.05），whereas serum levels of leucine，isoleusine，very low-density lipoprotein（VLDL）and low-density lipoprotein（LDL）were signifcantly decreased（P＜0.05）in acute exacerbation group，as compared to stable stage group. Obvious disturbance of energy，protein and lipid metabolism existed in acute exacerbation of COPD，as compare with those in stable stage group. Conclusions Acute exacerbation of COPD was associated with obvious disturbance in energy，protein and lipid metabolism. This conclusion needs to be proven by performing larger sample trials.

Chronic obstructive pulmonary disease Acute exacerbation Characteristic metabolite1H nuclear magnetic resonance Metabonomics

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生一般研究項目（2014KYB276）；浙江省中醫(yī)藥科研基金項目（2014ZA112）

310012 浙江省立同德醫(yī)院呼吸內科（楊秀云 黃飛華吳美倩）

314300 浙江省立同德醫(yī)院海鹽分院呼吸內科（張永建王曉平）

200331 上海天佑醫(yī)院重癥醫(yī)學科（楊中良）

*通信作者