PAK5和P-gp與上皮性卵巢癌相關性的臨床研究

鄒競慧 李笛悠 張 萍?

PAK5和P-gp與上皮性卵巢癌相關性的臨床研究

鄒競慧 李笛悠 張 萍?

目的 研究PAK5和P-gp與EOC臨床因素的相關性，為預測上皮性卵巢癌（EOC）進展及患者預后提供指導。方法 回顧分析自2013年1月至2015年6月接受手術治療且經病理確診為EOC的患者，回顧整理患者的病理類型、FIGO分期、細胞分化和化療耐藥等臨床資料，并用免疫組織化學方法測定EOC中PAK5和P-gp的表達量，分析PAK5和P-gp在EOC組織中的表達情況及與臨床資料的關系。結果 在EOC患者組織中，單因素分析，PAK5的陽性率在FIGO分期晚期組高于FIGO早期組，細胞低分化組高于中高分化組（P均＜0.01）。PAK5與病理類型陽性率無明顯差異（P＞0.05）。P-gp的陽性率在FIGO分期晚期組高于FIGO早期組，細胞低分化組高于中高分化組（P均＜0.01）。PAK5與病理類型陽性率無明顯差異（P＞0.05）。PAK5陽性率在耐藥組高于敏感組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。P-gp陽性率在耐藥組高于敏感組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。結論 PAK5和P-gp在EOC組織中均呈高表達，PAK5和P-gp陽性表達量與FIGO分期、細胞分化不良和化療耐藥有關，對預測上皮性卵巢癌疾病發(fā)展及患者預后有重要意義。

上皮性卵巢癌（EOC） PAK5，P-gp 免疫組織化學 病理類型 化療耐藥

卵巢癌是婦科疾病中僅次于宮頸癌和子宮內膜癌的常見腫瘤，惡性程度高，病死率居婦科惡性腫瘤之首。其中卵巢上皮性惡性腫瘤（EOC）約占卵巢原發(fā)性惡性腫瘤的85%～90%。其發(fā)病隱匿、進展迅速，約70%～80%的EOC患者在初診時已經處于晚期，病死率居婦科惡性腫瘤之首［1］。PAK5主要在成熟的神經組織中表達［2］，在正常的胃腸組織、胰腺、卵巢和睪丸等組織也有表達［3］。最近研究表明PAK5在一些腫瘤組織中過表達，并且隨著惡性程度增高，表達含量增高［4］。本實驗利用免疫組織化學方法測定PAK5和P-gp在原發(fā)性上皮性卵巢癌組織中的表達情況，分析PAK5、P-gp的表達與卵巢癌的耐藥、患者的生存及預后的相關性，以此評價這些分子靶標用于預后判斷的可能性。

1 臨床資料

1.1 一般資料 自2013年1月至2015年6月在本院婦科接受手術治療和術后化療，且有明確病理學診斷的原發(fā)性上皮性卵巢癌患者52例，年齡23～70歲，平均55歲。病理類型：漿液性癌27例，粘液性癌12例，透明細胞癌9例，子宮內膜樣癌4例。FIGO分期（2009年標準）：I～II期18例，Ⅲ～Ⅳ期34例。分化程度中高分化19例，低分化33例。所有患者均接受卵巢癌根治術或卵巢腫瘤減滅術；術后均接受正規(guī)的化療治療；術前均未接受任何形式的放療與化療；排除其他部位惡性腫瘤及非原發(fā)性、非上皮性卵巢癌；無嚴重的內科功能性或器質性病變；隨訪資料完整。

1.2 用藥方法 靜脈滴注3h/d，紫杉醇135～175mg/ m2，卡鉑按曲線下面積（AUC）510～715（AUC=5），d1，或順鉑（DDP）70～100mg·（m2/d），3周為1個周期，F(xiàn)IGO早期化療4～6周期，F(xiàn)IGO晚期化療6～8周期。為預防藥物反應，采取以下措施：（1）給藥前12h及6h口服地塞米松20mg。（2）化療前30min給予靜脈推注西米替丁及肌肉注射異丙嗪。（3）化療過程中進行心電監(jiān)護、充分液體水化，及藥物保護肝臟、抗嘔吐等治療。

1.3 復發(fā)評價 （1）腫瘤標記物升高。（2）影像學（B超、CT、MRI、PET-CT等）出現(xiàn)腫瘤復發(fā)、轉移征象。（3）體格檢查發(fā)現(xiàn)腫塊。（4）出現(xiàn)胸腹水。（5）不明原因腸梗阻。（6）其他（如不明原因的發(fā)熱等）。

1.4 化療藥物敏感性評價 腫瘤對化療藥物的不敏感表現(xiàn)包括以下三種情況，研究中［12］將腫瘤耐藥型、持續(xù)狀態(tài)型、頑固型歸為TP耐藥組，一線方案化療完成6個月后腫瘤復發(fā)稱為化療藥物敏感型復發(fā)，本研究將未復發(fā)及藥物敏感型復發(fā)歸為TP敏感組。（1）腫瘤耐藥：指以紫杉醇和鉑類為基礎的化療完成后6個月內出現(xiàn)的腫瘤進展。（2）腫瘤持續(xù)狀態(tài)：指計劃的一線方案化療完成后，仍然有臨床可測量的病灶以及穩(wěn)定病灶。（3）腫瘤頑固型：指鉑類藥物化療中，腫瘤仍在進展的情況。

1.5 實驗方法 （1）主要試劑：小鼠單克隆抗體Anti-PAK5抗體，Anti-P-gp抗體，SP免疫組化試劑購自美國Abcom公司產品，EDTA修復液，PBS溶液（0.01M）購于谷歌生物，DAB顯色劑購于國藥集團化學試劑有限公司，BSA（牛血清白蛋白）購于北京索萊寶科技有限公司。（2）實驗步驟：烘烤，脫蠟和水化，洗滌，抗原修復，洗滌，消除過氧化物酶，洗滌，封閉，加一抗，復溫，洗滌，加二抗，洗滌，孵育，顯色，復染，分化，返藍，脫水，透明，封片等。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PAK5和P-gp陽性表達與上皮性卵巢癌臨床病理因素 見表1。

2.2 PAK5和P-gp蛋白在卵巢癌紫杉醇耐藥及敏感組織中的表達 耐藥組PAK5蛋白陽性表達率59.0%（13/22）明顯高于敏感組陽性表達率20%（6/30），差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。耐藥組P-gp蛋白陽性表達率68.1%（15/22）明顯高于敏感組陽性表達率0%（0/30），差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

2.3 PAK5染色與陽性表達情況 見圖1。

表1 52例卵巢癌患者的臨床病例特征與PAK5，P-gp蛋白的表達（n）

圖1 卵巢癌組織中PAK5的表達（SP，×100）（AB為化療敏感組，CD為化療耐藥組）

2.4 P-gp染色與陽性表達情況 見圖2。

圖2 卵巢癌組織中P-gp的表達（SP，×200）（AB為化療敏感組，CD為化療耐藥組）

3 討論

EOC來源于卵巢表面的生發(fā)上皮，占卵巢癌的90%。根據(jù)病理組織學形態(tài)的不同，上皮性卵巢癌主要可分為漿液性癌、黏液性癌、子宮內膜樣癌、透明細胞癌、移行細胞癌以及混合性癌與未分類癌，其中漿液性癌占上皮性卵巢癌40%～55%。根據(jù)核分裂相計數(shù)和核異型程度，漿液性癌又可分為高級別與低級別性癌，研究表明，不同類型的上皮性卵巢癌的組織學結果和生物學行為存在較大差異［5］。臨床回顧性單因素分析，均在某種程度上證明患者的發(fā)病年齡、病理類型、FIGO分期、細胞分化程度等因素中的一種或多種對疾病進展及患者預后有影響［6］。本研究證明PAK5和P-gp在FIGO中晚期的陽性率明顯高于FIGO早期，因此，PAK5和P-gp陽性表達與FIGO分期晚期有關，對預測上皮性卵巢癌分期及疾病進展有指導意義。根據(jù)細胞生長異型性的程度，細胞可分為高、中、低分化，細胞分化代表了腫瘤細胞的惡性程度，分化不良的腫瘤體生長較迅速，而且侵襲力強，容易發(fā)生轉移，是導致疾病進展的重要因素。PAK5和P-gp在低分化組的陽性率明顯高于高中分化組。因此，測定PAK5和P-gp表達強弱與分布，可以幫助評估疾病的惡性程度。在病理類型為粘液性卵巢癌、子宮內膜樣癌及透明細胞性癌的比較中PAK5和P-gp陽性率差異均無明顯統(tǒng)計學意義，但漿液性癌的PAK5和P-gp陽性率略高于其他病理類型類型，有待納入更多患者的進一步分析。目前認為P-gp主要分布在有分泌功能的上皮細胞胞膜中，當化療藥物進入細胞后，P-gp識別并與之結合，隨后引起ATP結合區(qū)活化，從而水解ATP產生能量，導致跨膜通道的構象發(fā)生改變，主動將抗腫瘤藥物泵出細胞，降低細胞內藥物濃度，隨后再次發(fā)生ATP分子水解，P-gp恢復至原來的構象，從而導致腫瘤細胞耐藥性的產生。目前有研究發(fā)現(xiàn)P-gp的表達水平和活性狀態(tài)與細胞內絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）家族中Erk1/2的激活有關［7］，此外，向藥物敏感的卵巢癌細胞中轉染MDR1基因使其表達增高，可以導致Erk1/2信號通路的持續(xù)激活，但是對MAPK家族中另外兩個信號通路JNK和p38的激活無明顯影響。說明除作為藥物泵發(fā)揮作用，P-gp還通過介導細胞內信號傳導參與調節(jié)耐藥細胞的其他生物學行為。隨后進一步機理方面的研究發(fā)現(xiàn)P-gp的這種作用可能通過與其他蛋白質相互作用有關，如多項研究發(fā)現(xiàn)P-gp能夠與CD44、Anxa2及caveolin等存在相互作用，目前已知這些蛋白質在細胞內信號傳導過程均發(fā)揮重要作用［8］。

本資料結果表明，PAK5在EOC中過表達，且隨著卵巢癌惡性程度增加，PAK5表達量增高。PAK5與卵巢癌化療耐藥有關，下調PAK5表達增強卵巢癌對紫杉醇的敏感性。提示PAK5可能是卵巢癌紫杉醇耐藥的核心調節(jié)靶點，該蛋白可能參與紫杉醇對腫瘤細胞的殺傷作用和耐藥性的獲得。作者推測PAK5基因可能通過某種途徑作用于細胞骨架中的肌球蛋白和微管結合，影響細胞膜的功能，改變了細胞的抗藥性［9-10］。通過探索PAK5誘發(fā)EOC細胞耐藥的具體機制，為干預有效的信號轉導環(huán)節(jié)或研發(fā)新型腫瘤藥物提供新思路。

本實驗進一步論證了PAK5和P-gp在EOC中高表達，并發(fā)現(xiàn)PAK5的表達與FIGO晚期（Ⅲ+Ⅳ期）、組織分化不良及化療耐藥密切相關，PAK5和P-gp與這些臨床因素的關系為預測患者疾病進展、預后以及化療效果提供指導，在臨床檢測中可以加強對PAK5和P-gp的定性、定量檢測，藥物調節(jié)PAK5和P-gp的表達及信號傳導通路將可能成為抗上皮性卵巢癌耐藥治療的嶄新靶點。

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Objective To investigate the clinical factors correlation of PAK5 and P-gp in EOC，in order to provide guidance to predict disease progress and prognosis of EOC patients. Methods Research objects were the patients who accepted surgery in Department of Gynecology and were diagnosed epithelial ovarian cancer defnitely by pathological diagnosis in our hospital from January 2013 to June 2015. We carried out a retrospective study of the clinical factors，such as，pathological type，F(xiàn)IGO stages，cell differentiation，chemoresisitance and so on. Immunohistochemistry（IHC）staining was performed to investigate the expression of PAK5 and P-gp. Finally，we analyzed the expression of PAK5 and P-gp in EOC tissue and the correlation of PAK5 and P-gp and the above clinical factors. Results 1.The positive rate of PAK5 in FIGO advanced group was higher than in FIGO early group，the positive rate of PAK5 in poor cell differentiation group was higher than in well and moderate cell differentiation group（81.8%vs 47.3%），differences were statistically signifcant in the above factors（P＜0.01）. However，there was not signifcant difference in positive expression rate of PAK5 when grouped by pathological type（P＞0.05）.The positive rate of P-gp in FIGO advanced group was higher than in FIGO early group，the positive rate of P-gp in poor cell differentiation group was higher than in well and moderate cell differentiation group，differences were statistically signifcant in the above factors（P＜0.01）. However，there was not signifcant difference in positive expression rate of P-gp when grouped by pathological type（P＞0.05）.2.The positive rate of PAK5 in chemoresistance group was higher than in chemosensitivity group，differences were statistically signifcant in the above factors（P＜0.05）. The positive rate of P-gp in chemoresistance group was higher than in chemosensitivity group，differences were statistically signifcant in the above factors（P＜0.001）. Conclusion PAK5 and P-gp were high-expressed in epithelial ovarian cancer. The positive expression of PAK5 and P-gp were related to the FIGO late stages，poor cell differentiation，chemoresistance.PAK5 and P-gp could be used to predict the disease progression and prognosis of patients in epithelial ovarian cancer.

EOC PAK5 P-gp Immunohistochemistry（IHC） Pathological type FIGO stages Chemoresistance

200092 上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院婦科

*通信作者