Lnc RNA FER1L4對神經膠質瘤細胞增殖侵襲和凋亡能力的影響

夏 亮 孫才興 馮 方 吳 斌?

·基礎研究·

Lnc RNA FER1L4對神經膠質瘤細胞增殖侵襲和凋亡能力的影響

夏 亮 孫才興 馮 方 吳 斌?

目的 研究Lnc RNA在神經膠質瘤細胞中的表達，及其對膠質瘤細胞增殖，侵襲及凋亡能力的影響。方法 采用RT-PCR檢測Lnc RNA FER1L4在不同膠質瘤細胞株S373-MG，U251，U87-MG，SHG-44，LN-18和對照星形膠質細胞1800中的的表達，SiRNA技術沉默FER1L4表達后，采用CCK-8，Transwell侵襲實驗，流式細胞技術檢測膠質瘤細胞增值、侵襲、凋亡的變化。結果 Lnc RNA在膠質瘤細胞株中表達明顯高于正常對照星形膠質細胞。SiRNA下調Lnc RNA表達后，發現神經膠質瘤細胞增殖與侵襲能力明顯下降，凋亡細胞數明顯增加。結論 Lnc RNA FER1L4可能在膠質瘤發生與發展過程中發揮了重要作用。

長鏈非編碼RNA FER1L4 生物學功能

膠質瘤是最常見的原發性惡性神經系統腫瘤之一，盡管采取積極的手術治療，但目前絕大部分患者預后仍較差，尤其是膠質母細胞瘤，其平均生存期≤2年［1］。研究證實，神經膠質瘤的發生和發展與各種癌基因或抑癌基因異常表達密切相關［2］。長鏈非編碼 RNA（LncRNA）是一類不編碼蛋白質并且轉錄本長度＞200 個核苷酸的RNA。目前研究已證實LncRNA 與不同人類惡性腫瘤的發生發展密切相關，一些 LncRNA 在腫瘤與正常組織中存在差異表達，而這些差異表達的 LncRNA 可能參與了腫瘤的發生與發展過程［3］。FER1L4作為長鏈非編碼RNA的重要成員之一，其與腫瘤發生與發展密切相關，近年來多個研究已證實FER1L4表達與結腸癌和胃癌發生密切相關［4］。本研究旨在探討FER1L4與膠質瘤細胞增殖、凋亡與侵襲的關系，為神經膠質瘤的早期診斷和治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 神經膠質瘤細胞U251，U87-MG，SHG-44，S373-MG，LN-18，以及對照正常星形膠質細胞1800均購自中科院上海生命科學研究院細胞資源中心。胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶，DMEM細胞培養液、Trizol及Lipofectamine2000 轉染試劑均為Invitrogen公司產品；細胞培養耗材為BD公司產品；FER1L4引物由上海Invitrogen公司設計合成；SiRNA干擾序列由Life技術公司提供，siRNA干擾序列正義鏈5'-UUAACUCGAAGCUGUCCUGTT-3'，反義鏈：5'-CAGGACAGCUUCGAGUUAATT-3'，對照組正義鏈：5'- ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'反義鏈：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'。CCK-8細胞活性檢測試劑盒購于日本同仁化學公司；Transwell小室購自Millipore公司，Matrigel由BD公司生產；AnnexinVFITC/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物公司；引物合成及測序在上海Invitrogen 公司完成。

1.2 方法 （1）細胞培養：神經膠質瘤及正常星形膠質細胞1800均培養于含10%胎牛血清，1%青鏈霉素的DMEM培養基，培養溫度為37℃，5%CO2的培養基中培養。細胞融合度達80%時傳代及進行相關操作。轉染前24h，細胞接種于六孔板，約4×105個細胞/孔，加入含10%血清的培養基，放入培養箱中培養過夜，待細胞約70%～80%匯合度時進行轉染。加入質粒4μg/孔和轉染試劑10μl，同時轉染空載體作為陰性對照，同時將培養基換成無血清培養基。轉染6h后更換培養基。（2）PCR：Trizol法提取細胞總RNA，用紫外分光光度計定量，按逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，RT-PCR擴增。FER1L4引物正義鏈：5'CCGTGTTGAGGTGCTGTTC-3'；反義鏈：5'GGCAAGTCCACTGTCAGATG3'。內參GAPDH正義鏈：5'：AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3' 反義鏈：5'AATGAAGGGGTCATTGATGG-3'。PCR反應條件為95℃2min預變性，95℃30s，55.4℃30s，74℃30s，共35個循環，72℃10min延伸。PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳，發光成像系統拍照，以FER1L/GAPDH灰度值比值作為FER1L的相對表達量。（3）細胞轉染：轉染前1d，將細胞接種于六孔板，4×105個細胞/孔，加入2ml含10%血清的培養基，放入培養箱中培養過夜，待細胞匯合度在70%～80%時進行轉染。加入質粒4μg/孔和轉染試劑10μl，同時轉染空載體作為陰性對照，同時將培養基換成無血清培養基。轉染6h后更換培養基。（4）CCK-8細胞增值實驗：取對數生長期細胞，約5000個細胞份額分別接種于96孔板中培養，并設3個復孔。轉染24h、48h、72h、96h后分別加入CCK-8溶液10μl/孔，再次放入培養箱中培養2h，酶聯免疫檢測儀于450nm處測定每孔吸光值，比較各組細胞的生長情況。（5）Transwell侵襲實驗：在Transwell小室中鋪Matrigal goal，放入培養箱，待基底膜干燥后，滴入單細胞懸液培養24h，顯微鏡下觀察各組穿透基底膜的細胞數量，隨機計數5個視野，取平均值。（6）Annexin V/PI凋亡實驗：當各組細胞融合度達80%左右時，洗凈培養基，0.25%胰蛋白酶消化細胞，收集細胞，PBS洗滌細胞3次，懸浮細胞。懸浮液中加入5μl Annexin V-FITC，緩慢混勻后孵育15min。加入10μl PI后緩慢混勻于（2～8）℃避光條件下孵育5min。在30mins內流式細胞儀檢測。判定標準：左下象限顯示活細胞，為（FITC-/PI-）；左上象限是晚期凋亡細胞，為（FITC+/PI-）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細胞，顯現（FITC+/PI-）。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗；P＜0.05為差異有統計 學意義。

2 結果

2.1 體外證實長鏈非編碼RNA FER1L4高表 達于膠質瘤細胞 PCR檢測不同膠質瘤細胞S373-MG，U251，U87-MG，SHG-44，LN-18，以及對照星形膠質細胞1800中FER1L4的表達情況，分別為（1.563±0.250），（1.887±0.285），（1.260±0.178），（1.358±0.301），（0.583±0.210），（0.263±0.080）。結果顯示FER1L4在所有膠質瘤細胞中表達均高于對照正常星形膠質細胞，且其在膠質瘤 細胞S373-MG和U251表達最高。

2.2 SiRNA干擾LncRNA FER1L4的表達 為進一步研究LncRNA FER1L4在膠質瘤細胞 中的生物學功能，選取高表達FER1L4細胞株S373-MG和U251，通過SiRNA處理兩株細胞48h后，S373-M G和U251細胞中FER1L4表達均明顯下調［（1.919±0.185）vs（0.694±0.131），P=0.005；（1.583±0.1145）vs（0.630±0.104），P=0.004）］。

2.3 LncRNA FER1L4對膠質瘤細胞增值，凋亡和侵襲能力的影響 采用 SiRNA干擾FER1L4表達后，采用CCK-8、Transwell侵襲實驗，流式細胞凋亡技術檢測膠質瘤細胞增值侵襲 凋亡的變化。CCK-8實驗檢測細胞增殖的結果顯示，S373-MG和U251細胞Si-FER1L4組（干擾組）細胞的存活率均明顯低于Control組（對照組）（P=0.003，P=0.001）（見圖1）。AnnexinV PITC/PI雙染法檢測細胞凋亡的結果顯示，Si-FER 1L4組發生凋亡的細胞比例均高于Control組［S373-MG：（23.00±1.732）vs（10.220±1.283），P=0.004；U251：（29.00±1.732）vs（19.330±1.856），P=0.019）］。Transwell實驗檢測結果顯示，Si-FER1L4組細胞每個視野的穿膜數量均低于Control組［S373-MG：（17.00±2.082）vs（62.67±2.963），P=0.0002；U251：（24.67±1.764）vs（72.33±2.603），P=0.0001］（見圖2）。

圖1 FER1L4下調表達對神經膠質瘤細胞U251（A）及U373-MG（B）增殖的影響

圖2 FER1L4下調表達對神經膠質瘤細胞U251及U373-MG侵襲能力的影響

3 討論

進一步研究和揭示神經膠質瘤的分子發病機制，尋找新的治療途徑和基因治療靶點，一直以來是神經膠質瘤相關研究領域的熱點［2］。LncRNA作為RNA 聚合酶Ⅱ轉錄的副產物，開始被認為是基因轉錄的“垃圾”，并不具備生物學功能。然而，近年的相關研究證實，LncRNA具有諸多生物學功能，包括參與染色質修飾、染色體沉默、轉錄調控等多種生物學過程；以多種形式影響蛋白功能；影響miRNA含量［4］。

目前研究證明，膠質瘤的發生發展與LncRNA異常表達 關系密切［5］。目前 在神經膠質瘤中相對研究較多的LncRNA有MEG3和H19等。MEG3作為第一個被發現的具有腫瘤抑制作用的LncRNA，相對于正常組織，其在對應的腫瘤組織中表達下調。在82%的膠質瘤中，MEG的表達呈現缺失或大幅下調，MEG3的表達下調進而調節p53的活性，有利于膠質瘤細胞在體外的生長。因此，MEG3 可能是膠質瘤發生、發展的調節因子，也可能成為膠質瘤治療的新靶點［6］。H19 為最早發現的LncRNA之一，屬于母源性印跡基因，其高表達于胚胎發育期的內胚層及中胚層來源的組織［4］。研究證實，H19 同時具有致瘤和腫瘤抑制的雙重功能。Yan等對神經膠質瘤組織和細胞中H19的表達及生物學功能進行研究，發現H19 表達與腦膠質瘤的WHO分級及惡性程度密切有關，H19可通過下調下游靶基因miR-675及CDH13從而發揮促進膠質瘤細胞的生長與增殖的作用［4］。另有研究證實，H19還可調節星形膠質細胞 瘤形成的關鍵信號蛋白CLI1的表達活性，從而發揮相應的腫瘤生物學功能［4］。

FER1L4作為一種新發現 的長鏈非編碼RNA，目前研究主要集中在胃癌和結腸癌。Liu等［7］的研究中，首先證實相對應癌旁組織，FER1L4在91.80%的胃癌組織中表達明顯下調，且FER1L4的低表達與胃癌的腫瘤體積、惡性程度、淋巴及遠處轉移、浸潤深度、TNM分期、血管神經浸潤和血清CA72-4表達均明顯相關，因此，結果證實FER1L4的表達高低可作為胃癌早期診斷的較為優良的重要指標。隨后研究表明FER1L4能夠作為一種重要的內源性競爭RNA，且在結腸癌中扮演了抑癌基因的作用，其表達與miR-106a-5p表達明顯負相關，兩者的表達 均與結腸癌腫瘤浸潤深度、血管侵襲、淋巴結轉移及臨床分期密切相關［8］。通過外源性增加FER1L4的表達能夠明顯下調miR-106a-5p表達，從而影響結腸癌的增殖、遷移和侵襲。上述研究均證實，FER1L4在胃癌和結腸癌中可能扮演了抑癌基因的作用，且其表達高低可作為胃癌及結腸癌早期診斷和預后評價較為優良的指標。

本實驗通過檢測不同膠質瘤細胞及正常對照星形膠質細胞中FER1L4的表達，發現FER1L4在膠質瘤細胞中明顯高于對照星形膠質細胞。同時，下調FER1L4可顯著抑制膠質瘤腫瘤細胞的增殖和侵襲力，促進細胞凋亡，提示LncRNA FER1L4基因可能具有抑癌的功能，在神經膠質瘤的發生、發展中發揮作用，有望為神經膠質瘤的早期診斷和基因治療提供更有效的作用靶點。然而，LncRNA FER1L4影響神經膠質瘤細胞增殖、凋亡和侵襲能力的途徑及具體分子機制仍然未知，需進一步的深入研究。

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Objective To determine the expression of LncRNA FER1L4 and evaluate its clinical value in glioma. Methods The expression of LncRNA FER1L4 in glioma cell lines S373-MG，U251，U87-MG，SHG-44 and normal astrocyte 1800 was determined by RT-PCR. SiRNA targeting FER1L4 was transfected into S373-MG and U251 glioma cell lines，and cell proliferation，invasion，and apoptosis were examined by CCK-8 assays，transwell chamber assays，and Annexin V/PI analysis，respectively. Results The expression of FER1L4 in glioma cell lines was obviously higher than that in the normal astrocyte. Furthermore，by down-regulating FER1L4 using siRNA，the invasiveness and proliferation of the astrocyte decreased considerably，while the apoptosis increased. Conclusions FER1L4 plays an important role in the occurrence and progression of glioma.

LncRNA FER1L4 Biological function

國家自然科學基金（812713681）；浙江省腫瘤醫院青年科研基金（QN201402）

310022 浙江省腫瘤醫院

*通信作者