自噬在惡性腫瘤中的研究進展*

張　露，蔣夢彤 綜述，陳　罡，李　佳審校（廣西醫科大學第一附屬醫院病理科，廣西南寧530021）

自噬在惡性腫瘤中的研究進展*

張露，蔣夢彤 綜述，陳罡，李佳△審校
（廣西醫科大學第一附屬醫院病理科，廣西南寧530021）

自噬；腫瘤；溶酶體；細胞器；綜述

自噬（autophagy）是真核細胞內的一種降解途徑，能通過溶酶體使細胞內受損的細胞器及蛋白質等成分降解，廣泛存在于人體的正常細胞和惡性腫瘤細胞中。自噬與惡性腫瘤的關系是近年生物醫學領域的研究熱點，多數研究采用不同的方法探討二者的關系，而研究結論偏向于自噬在惡性腫瘤中起著促進與抑制的雙重作用，但針對這些研究方法的文獻綜述較少。本文針對自噬在惡性腫瘤中常用的研究方法及其優缺點進行綜述，以期為惡性腫瘤研究工作中自噬研究方法的選擇及結果解釋提供幫助。

1　自噬與惡性腫瘤

自噬的概念最先由比利時科學家Christian de Duve提出，它是真核細胞內的一種降解途徑，能通過溶酶體使細胞內受損的細胞器及蛋白質等成分降解。自噬性降解是機體內的一種病理生理過程，這一過程主要包括隔離膜（isolation membrane）或吞噬泡（phagophore）的形成及延伸、自噬體（autophagosome）的形成、自噬體和溶酶體融合形成自噬溶酶體（autolysosome），最終胞內物質降解，產生的降解產物如氨基酸、脂肪酸等可被細胞再利用。自噬現象的出現是以實現細胞的穩態和細胞器的更新為目的，對細胞來說是一種有利的修復與防御機制。Meijer等［1］的研究表明，哺乳動物細胞有著基礎的自噬來降解并回收損傷的細胞器及蛋白質，同時，自噬降解后的產物可為細胞提供生存所必需的能量。而Gozuacik等［2］的研究提出了一些惡性腫瘤的發生伴隨有自噬水平的抑制。自噬與惡性腫瘤的關系吸引了眾多研究人員的關注，成為國際學術界的研究熱點。大量研究發現，自噬與惡性腫瘤的耐藥、復發和轉移相關［3］，而自噬相對惡性腫瘤的發生、發展來說是一把“雙刃劍”［4］，既可起到促進的作用又可表現出抑制的效果。作者認為這除了與自噬本身的復雜性和其作用于惡性腫瘤的方式、途徑及分子機制不盡相同相關外，還與研究自噬所采用的方法相關。

2　自噬的人工干預和調節

正常情況下培養的細胞自噬活性很低，而一些惡性腫瘤的自噬水平又是受抑制的［2］。這不利于自噬現象的觀察，對自噬進行人工干預和調節就顯得很有必要。研究中常用工具藥實現，有時根據研究目的，使用到一些遺傳學技術，可以在基因的分子水平上對自噬進行干預。

2.1工具藥自噬的工具藥可分為與自噬相關的抑制劑和誘導劑2種。常用的自噬抑制劑有3-甲基腺嘌呤（3-MA）［5］、巴弗洛霉素A1［6］及氯喹［7］，而常用的自噬誘導劑有西羅莫司、氯化鋰［8］及構造營養缺乏的環境［9］。工具藥可以根據不同的原理干預和調節自噬，例如，3-MA可抑制ClassⅢ磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信號通路來抑制自噬體的形成，以此阻斷自噬發生的步驟，而西羅莫司可抑制mTOR通路，以此誘導自噬活性增強。因此，工具藥的選擇應根據研究目的而定。

2.2遺傳學技術自噬的遺傳學技術包括RNA干擾（RNAi）技術與近年發展起來的CRISPR-Cas9技術［10］（最新出現的一種由RNA指導的Cas9核酸酶對靶向基因進行編輯的技術）。RNAi是指利用與靶基因序列同源的雙鏈RNA（dsRNA）可誘導特異性基因沉默的一種現象，因此RNAi技術可用于沉默或直接敲除目標基因的表達，同時具有較高特異性的特點，該技術目前普遍用于基因分子水平上的研究。通過RNAi技術沉默惡性腫瘤中與自噬相關的基因，觀察自噬活性的變化，從而得出自噬與惡性腫瘤間的聯系，可以為惡性腫瘤的靶向治療提供新思路［11］。CRISPR-Cas9技術被稱為接近目標基因組編輯的最終工具包，因其在基因組編輯中所體現出的超高的效率和簡易的技術而吸引著眾多科研工作者，同時被認為是在體細胞基因分子水平治療上的一個新機遇［12］。Kim等［13］通過CRISPR-Cas9技術成功敲除自噬相關基因ATG5［14］，用以研究敲除ATG5后的黑色素瘤細胞中自噬抵抗BH3模擬棉酚所起的保護作用。CRISPR-Cas9技術開啟了自噬與惡性腫瘤關系研究方法上的新篇章，而對于通過自噬相關分子及基因治療惡性腫瘤，更是提供了無限的可能與巨大的探索空間。綜上，遺傳學技術相比工具藥特異性更強，二者相互結合，可以更好地使研究者根據研究目的對自噬進行人工干預和調節。

3　自噬的檢測方法

自噬在體內是一個隨時間不斷變化的過程，自噬發生的步驟猶如一條“流水線”，先是隔離膜或吞噬泡的集結和延伸，接著自噬體形成，形成的自噬體與溶酶體融合，最后自噬性底物降解，產物就會被輸送至細胞質中為細胞提供能量。為了保證細胞快速適應惡劣環境的變化，這一“流水線”的過程就會非?？?，使自噬現象的檢測比較困難。目前，自噬的檢測方法主要基于這條“流水線”中的某一“時空點”或者某一“時空段”，相對自噬這一動態過程，這些檢測方法本質上均是靜態的。

3.1基于“時空點”的檢測該類檢測常用的有透射電子顯微鏡、LC3免疫印跡及LC3單熒光檢測，這些均基于自噬體的直接或間接檢測原理。

3.1.1透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡主要通過觀察自噬性結構［15］的形成及數量來判斷自噬的發生，所觀察的自噬性結構中最主要的是自噬體，因此是自噬體的直接檢測方法［16］。透射電子顯微鏡檢測結果的準確性基于觀察者對自噬體在鏡下結構的準確判斷，這就不可避免地存在一定的主觀性，同時，樣本的制備也可影響觀察者的判斷。例如，脂質雙分子層受制備過程所用試劑的影響而發生改變，影響對自噬體膜的判斷，也可因不同切面自噬體數量不一而在推算整個細胞的自噬情況時結果出現誤差。由此可見，透射電子顯微鏡探索自噬現象是基于形態學的觀察，同樣存在著不足的地方，使用時應結合其他檢測來相互驗證。

3.1.2LC3免疫印跡LC3為自噬體膜上多功能標記蛋白［17］。自噬形成時，彌漫于細胞質中的LC3（即LC3-Ⅰ）與磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）偶聯，轉變成LC3-Ⅱ附著于自噬體膜上，當自噬體向溶酶體呈遞后方才降解消失。因此，通過免疫印跡檢測LC3-Ⅱ的表達或測定LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比值可以從一定程度反映自噬體數量的多少［18］，這種檢測即是基于自噬體間接的檢測原理。這一方法的缺陷在于LC3抗體對LC3蛋白的2種類型親和力不相同，對LC3-Ⅱ有更高的親和力，因此會出現較高的假陽性率。

3.1.3綠色熒光蛋白（GFP）-LC3單熒光檢測該方法的檢測原理也是基于LC3在自噬形成過程中與PE偶聯并錨定于自噬體膜上的現象，利用GFP與LC3融合，根據熒光顯微鏡下綠色熒光斑點來示蹤自噬形成［19］。自噬沒有發生時，GFP-LC3融合蛋白彌漫分布于細胞質中，而當自噬發生之后，GFP-LC3融合蛋白就會集結且錨定在自噬體膜上，此時使用熒光顯微鏡即可觀察到相對明顯的綠色熒光斑點，而這些斑點代表的就是自噬體，再通過計數斑點數，就可以估測自噬體的數量。

3.2基于“時空段”的檢測該種檢測有別于“時空點”檢測?！皶r空點”檢測得出的結果大多解釋為自噬體數量的多少，而這可能由于自噬某一通路受阻使得自噬體數量多少與自噬活性強弱不相符［20］?！皶r空段”的檢測包含了自噬形成的多個步驟及自噬降解過程的檢測，因此可檢測到自噬流（autophagic flux）［21］，這使得在形態學檢測基礎上進一步進行功能學檢測成為可能，可在一定程度上得知自噬活性的強弱，但仍舊無法實時地監測自噬現象所發生的全部過程。“時空段”常見的檢測方法有紅色熒光蛋白（RFP）-GFP-LC3雙熒光檢測、LC3動態檢測、長壽命蛋白降解檢測。

3.2.1RFP-GFP-LC3雙熒光檢測在GFP-LC3單熒光指示體系的基礎上，增加RFP，利用GFP在酸性環境下其綠色熒光會發生淬滅而RFP對酸性環境不敏感及其紅色熒光不會發生淬滅的原理進行自噬活性的檢測［22］。結果判讀時，通過顯微鏡成像后紅綠熒光融合，融合后出現的黃色斑點即是自噬體，紅色斑點是自噬溶酶體。因此，可通過計數不同顏色的斑點來反映自噬流的強弱。這種檢測方法的缺點在于不能反映出自噬降解的過程，同時，溶酶體酶的活力及其pH值也可影響信號的檢測。

3.2.2LC3動態檢測從自噬體形成、自噬體向溶酶體呈遞，到自噬性底物降解，這些步驟的發生均伴隨著LC3量的不斷變化。通過LC3動態檢測，即可將這個變化的過程反映出來，從而反映自噬活性的強弱。LC3動態檢測所采用的技術手段有免疫印跡，也可通過流式細胞儀檢測，也有研究通過加入一種溶酶體抑制劑來比較LC3-Ⅱ前后的差別，得出加入溶酶體抑制劑后LC3-Ⅱ表達增多的那部分，代表的即是被溶酶體所要降解的自噬體［23］。

3.2.3長壽命蛋白降解檢測哺乳動物體內蛋白質的降解可通過蛋白酶體ATP依賴的泛素降解和溶酶體ATP非依賴降解2種途徑，蛋白酶體主要負責降解短壽命蛋白，而長壽命蛋白則主要通過溶酶體途徑降解。根據溶酶體降解長壽命蛋白并在自噬誘導后與自噬體相融合的特性，將同位素標記法應用于細胞培養基，細胞合成的蛋白就會被同位素標記，而后把細胞轉移至不含同位素的普通細胞培養基，使被標記的短壽命蛋白優先降解，隨后開始自噬誘導，誘導后自噬活性增強，長壽命蛋白隨之降解，此時測定上清液的放射活度，即反映出細胞經由自噬來降解底物的能力［24］。

4　自噬在體內的研究方法

自噬在體內的研究方法已有先例，Mizushima［25］已成功構建GFP-LC3轉基因小鼠，使得體內實時監控自噬成為可能。但目前有關自噬在體內的研究方法的文獻不多，因此，使用GFP-LC3轉基因小鼠進行體內自噬研究時，要結合體外自噬的檢測方法，以避免單一方法的局限性。

5　小結與展望

本文簡單概述了自噬與惡性腫瘤的研究現狀并列舉了自噬的人工干預和調節方法、自噬的檢測方法及自噬在體內的研究方法，這些方法普遍應用于惡性腫瘤中自噬現象的研究。遺憾的是，目前還沒有一種方法可以準確可靠而特異地檢測自噬，因此，自噬在惡性腫瘤中表現出的抑制與促進的雙重作用也可能與自噬的研究方法使用不當相關。為了避免研究方法引起實驗結果解釋上的錯誤，就需要研究者理性地評估每一個研究結論。同時，自噬研究方法上的不足也為有志研究這一領域的科研工作者提供了巨大的探索空間，自噬與惡性腫瘤關系的研究也有望為惡性腫瘤的臨床治療提供新靶點。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2016.07.020

A

1009-5519（2016）07-1018-04

廣西壯族自治區自然科學基金青年基金（2015GXNSFBA139158）。

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（2015-12-19）