5-脂氧合酶的活性調節及抑制劑研究進展*

秦華迪綜述，常　靜，秦春常△審校（重慶醫科大學附屬第一醫院：.麻醉科；.心內科，重慶40007）

5-脂氧合酶的活性調節及抑制劑研究進展*

秦華迪1綜述，常靜2，秦春常2△審校（重慶醫科大學附屬第一醫院：1.麻醉科；2.心內科，重慶400017）

花生四烯酸鹽5-脂氧合酶；脂氧合酶抑制劑；活化；調節；綜述

5-脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LO）是催化花生四烯酸（AA）生成具有生物活性的白三烯（leukotrienes，LTs）的關鍵酶［1］。近年來研究發現，5-LO的調節在哮喘、炎癥、過敏性鼻炎、組織缺血再灌注損傷、心血管疾病及部分惡性腫瘤等疾病的發生、發展過程中均有非常重要的意義［2］。因此，關于5-LO酶活性的調節和抑制劑的研發已成為一個熱門課題，本文就其活性調節和抑制劑的研究進展綜述如下。

1　5-LO酶活性的調節

1.15-LO5-LO在哺乳動物各組織中分布十分廣泛，其相對分子質量為72×103～80×103，是由672或673個氨基酸殘基組成的單體酶，主要由N-末端的β-barrel結構和催化區域C-末端的α螺旋結構構成。α螺旋結構內含有1個非血紅蛋白Fe2+，是反應時電荷的供體和遞體。氨基端擁有C2結構含有典型配體結合環，配體結合環能與Ca2+和細胞膜相結合［3］，Ca2+通過誘導5-LO與細胞膜相結合，從而激活5-LO。靜息狀態下的5-LO在不同的細胞分布不同，如在中性粒細胞，嗜酸性粒細胞或腹膜巨噬細胞中，5-LO最主要分布在細胞質區域；而在肺泡巨噬細胞、朗格漢斯細胞中，5-LO主要分布在細胞核區域。

1.2鐵離子與脂質過氧化物5-LO活化中心的非血紅素鐵離子是5-LO激活所必需的，Hammarberg等［4］通過電子順磁共振發現靜息狀態下呈Fe2+形式，激活狀態下呈Fe3+形式，在催化過程中鐵離子在＋2價和＋3價之間循環。在細胞中，脂質過氧化物能氧化5-LO中的Fe2+轉化為Fe3+，使5-LO具有生物活性，但過氧化氫對5-LO無激活作用。Radmark等［5］發現，谷胱甘肽過氧化物酶可以通過減少脂質過氧化物的生成抑制5-LO的活性。

1.3Ca2+5-LO的活性與Ca2+有關，當Ca2+濃度為4～10μmol/L，全部 5-LO的活性可激活；Ca2+濃度為 1～2μmol/L，僅有一半5-LO的活性可激活。但即使無Ca2+，5-LO也具有一定的生物活性［6］。細胞應激反應誘導的5-LO激活就不依賴于Ca2+。每分子5-LO最多可以與2分子Ca2+可逆結合。Ca2+還可以調節5-LO與脂質氫過氧化物的親和力；Ca2+激活 5-LO需要磷脂酰膽堿（Phos phatidylcholine，PC）或類毛狀蛋白（coactosin-likeprotein， CLP）存在，如此Ca2+才能有效地綁定到“支架”上。Ca2+還可對抗谷胱甘肽過氧化物酶對5-LO活性的抑制［7］。此外Mg2+、Ba2+、Sr2+和Mn2+可以部分激活5-LO的活性，但這些+2價陽離子不屬于催化機制。

1.4三磷酸腺苷（ATP）最早發現對5-LO酶有激活作用的物質是ATP，但單獨的ATP不能激活5-LO的活性，必須在Ca2+同時存在時才能激活5-LO。ATP與5-LO結合使5-LO酶活性增加，對5-LO酶具有穩定作用，但目前ATP與5-LO的結合位點尚未確定。

1.5PCPande等［6］在人類白細胞中提純5-LO發現，PC能代替細胞膜作為5-LO活性的刺激因子，并且能穩定5-LO活性酶活性。研究發現，5-LO的C2結構對陽性離子的PC的結合力高于陰性離子的磷脂酰絲氨酸和磷脂酰甘油。無Ca2+時，雖然此時PC與5-LO的結合力最大，但這種結合不能激活5-LO［8］；Ca2+存在時，增加5-LO與PC結合的疏水性，變為“生產”模式［6］。有趣的是，加入膽固醇或膽固醇硫酸鹽可以抑制5-LO的活性［7］。

1.6甘油酯和CLP研究發現，多種甘油酯均可以激動5-LO活性，但其中1-油酰基-2-乙酰基-sn-丙三醇（1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol，OAG）作用最明顯。OAG主要作用于5-LO的C2區域［9］。Ca2+、磷脂、PC可以抑制OAG 對5-LO刺激效應。同Ca2+一樣，OAG可對抗谷胱甘肽過氧化物酶對5-LO活性的抑制［10］。CLP是結合蛋白中的一員，CLP與5-LO的結合綁定需在完整的細胞中發生，5-LO與F-肌動蛋白相競爭與CLP相結合。CLP可以上調激動5-LO活性［11］。當無PC時，CLP可以替代PC激活5-LO，當CLP和PC同時存在時可以提高5-LO的活性，這是通過色氨酸殘基與5-LO的配體結合環相結合，即蛋白的相互作用實現的。實驗發現，CLP、5-LO以靜息狀態存在于胞質區域，給予Ca2+載體刺激后，5-LO、CLP轉位到細胞核區域，因此，沒有Ca2+，CLP依然可以綁定5-LO，但需要Ca2+才能激活5-LO［12］。

1.75-LO激動蛋白 （5-lipoxygenase actin protein，FLAP）FLAP相對分子質量約為18×103，包含2個親水環和3個跨膜區，主要分布在細胞核膜或內質網膜上。缺乏FLAP或給予FLAP抑制劑，5-LO就不能將內源性的AA催化生成LTA4，因此，FLAP是激活5-LO所必需的。一些觀點認為，FLAP除了能為5-LO與膜結合提供位點，還作為轉移蛋白結合AA，呈遞給5-LO。FLAP能增強5-LO的生物活性［13］。

1.85-LO的磷酸化5-LO的氨基酸序列包含有幾個蛋白激酶的序列，5-LO的磷酸化受到激酶A（PKA）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）調節的MAPKAPK-2/3、ERK1/2的調節。給予細胞刺激（如細胞應激、佛波醇酯），激活MAPKAPKs和ERKs誘導Ser271或Ser663磷酸化，促使5-LO異位，提高5-LO的活性，但易被蛋白激酶抑制劑所抑制［14］。細胞中，磷酸化的5-LO在很低的Ca2+濃度即可激活5-LO活性［15］。當5-LO中Ser271或Ser663突變為丙氨酸時，5-LO被p38MAP KAPK磷酸化明顯減少；外源性的腺苷和cAMP可激活PKA誘導Ser523磷酸化，細胞外和細胞內的5-LO活性均可直接抑制［14］。AA和油酸可以促進Ser271、Ser663磷酸化，同時抑制Ser523磷酸化，使5-LO活性增加，提高5-LO產物的合成［16］。

2　5-LO及其產物抑制劑

為了干預5-LO的活性及其產物的合成，5-LO及其產物抑制劑主要從以下3個途徑抑制：抑制cPLA2酶、FLAP抑制劑及直接抑制5-LO。

2.1cPLA2酶抑制劑cPLA2酶抑制劑，如糖皮質激素可抑制所有類花生酸的形成，cPLA2基因敲除小鼠也能抑制類花生酸合成。盡管實驗中糖皮質激素可明顯減少類花生酸，但在臨床研究中，cPLA2酶抑制劑對抑制LTs生成是無效的。有研究結果顯示，選擇性cPLA2酶抑制劑雖然對關節炎［17］、急性肺損傷［18］和（或）缺血再灌注損傷［19］的實驗動物模型有一定的治療作用，但不能完全降低LTs水平。

2.2FLAP抑制劑FLAP抑制劑即通過拮抗FLAP，干擾其結合底物AA呈遞給5-LO，并且干擾5-LO與FLAP定位結合。在完整的細胞內FLAP抑制劑能抑制5-LO的活性，尤其在AA是內源性的［20］。相反，如果AA是外源性的就會損傷其功效。FLAP抑制劑對提純的5-LO不能抑制其產物生成。雖然FLAP抑制劑MK886、Bay-X 1005或MK0591對分離的白細胞有效，但是在血液化驗中，藥效要弱50～200倍，可能由于血漿中其他蛋白競爭綁定藥物或AA。研究發現，FLAP抑制劑AM103是一種強有效的和選擇性FLAP抑制劑，在體內具有卓越的藥效性能，對急、慢性炎癥和休克動物模型均有效［21］。FLAP抑制劑AM803是一種吲哚衍生物，目前已完成臨床治療哮喘第二階段的部分研究，有望進入臨床使用［22-23］。

2.35-LO直接抑制劑

2.3.1抗氧化/游離基清除抑制劑這類抑制劑包括許多天然植物提取物（如咖啡酸、黃酮類、香豆素類等）及合成物（如AA-861、BW755C），這些藥物使催化中心的鐵離子始終保持在Fe2+狀態，不能進入循環，從而抑制5-LO活性。它們均是5-LO的高效抑制劑，但缺乏合適的口服生物利用度，因為這類抑制劑非特異性地抑制了體內普遍存在的氧化還原系統或活性自由基，導致高鐵血紅蛋白血癥等嚴重不良反應，從而阻止這類藥物的廣泛運用，發展緩慢。

2.3.2鐵配位體抑制劑鐵配位體抑制劑代表異羥肟酸或N-羥基脲衍生物，其不僅可螯合催化中心的鐵離子，還具有較微弱的還原性能力，其代表藥物Zileuton，有效的高選擇性5-LO抑制劑，半衰期為2.5 h，清除率為7.0mL/（min·kg），主要代謝途徑為N-羥基脲基團的葡萄糖醛酸化。Zileuton（IC50=0.5～1.0μm）可改善急性或慢性哮喘患者的氣道功能，減少β受體激動劑或糖皮質激素的用量，但作為美國唯一批準上市的5-LO抑制劑，其用于治療過敏性鼻炎、類風濕關節炎的療效一般。VIA-2291已完成動脈粥樣硬化和心血管疾病的二期臨床試驗，有可能在臨床應用［24］。將VIA-2291的結構優化后得到ABT-761，在支氣管痙攣的動物模型上其作用強于Zileuton4～5倍，半衰期為16h，但其臨床應用還有待開發。

2.3.3非氧化還原抑制劑非氧化還原抑制劑擁有與5-LO的自然底物不飽和脂肪酸類似結構，從而與AA 或LOOH競爭結合5-LO，它們經5-LO催化主要生成的代謝產物LTB5的生物活性僅為LTB4的1%。模擬底物抑制劑分子結構不同，本身缺乏氧化還原性能力，但卻不能排除其能改變5-LO的氧化還原狀態。其代表藥物有ZD2138、ZM230487屬于甲氧基四氫吡喃，該類藥物升高過氧化物濃度和（或）升高MAPKAPK-2/3、ERK1/2調控的5-LO磷酸化水平，可影響藥物對5-LO的抑制作用［25］。CJ-13610屬于咪唑類5-LO抑制劑，研究顯示，CJ-13610有很好的止痛效果，且不受5-LO磷酸化激活狀態的干擾，能更好地應用于哮喘、癌癥等疾病［26］。

3　小　結

5-LO及其代謝產物參與了許多疾病的發生、發展過程，了解5-LO活性的調節及其抑制，對5-LO相關疾病的研究有著重要作用。目前，對5-LO活性調節的了解是有限的，5-LO抑制劑也存在著毒性反應大、特異性低等問題，但相信不久的將來，有待研制出低毒、高效的5-LO抑制劑，造福人類的健康事業。

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2015-05-25

2015-11-15）