MAPK信號通路在炔雌醚誘導大鼠生精細胞凋亡中的作用研究

李　健，陳耀星，陳福寧，王子旭，曹　靜，董玉蘭

(1.河南科技大學動物科技學院，洛陽 471003； 2.中國農業大學動物醫學院，北京 100193；3.北京昌平區中西醫結合醫院，北京 102208)

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MAPK信號通路在炔雌醚誘導大鼠生精細胞凋亡中的作用研究

李健1*，陳耀星2，陳福寧3，王子旭2，曹靜2，董玉蘭2

(1.河南科技大學動物科技學院，洛陽 471003； 2.中國農業大學動物醫學院，北京 100193；3.北京昌平區中西醫結合醫院，北京 102208)

摘要：旨在探討MAPK信號通路在炔雌醚誘導大鼠生精細胞凋亡中的作用。將20只8周齡雄性SD大鼠隨機分為4組，適應飼養1周后，按體重分別以0.00、0.01、0.10、1.00 mg·kg-1腹腔注射溶解于橄欖油的炔雌醚，50 μL·只-1，每天1次，連續1周。處理結束后，取睪丸并制備組織切片，通過HE染色觀察睪丸組織結構的變化；通過免疫組織化學方法檢測睪丸生精細胞PCNA、MAPK信號通路磷酸化ERK(p-ERK)、磷酸化JNK(p-JNK)及磷酸化P38(p-P38)蛋白表達，TUNEL法檢測細胞凋亡。結果顯示，炔雌醚處理后大鼠睪丸曲細精管上皮厚度下降，各級生精細胞數量顯著減少，細胞皺縮，間隙增大，結構松散，管腔內成熟精子數量減少。生精細胞PCNA與p-ERK蛋白表達顯著減少；TUNEL、p-JNK蛋白及p-P38蛋白表達則顯著增加。綜上表明，炔雌醚暴露通過影響MAPK信號傳導通路抑制生精細胞增殖，促進細胞凋亡，最終抑制大鼠睪丸發育。

關鍵詞：MAPK信號通路；PCNA；炔雌醚；生精細胞；凋亡

環境內分泌干擾物通過誘導氧化應激、抑制細胞增殖及促進生精細胞凋亡等途徑造成一系列的生殖功能紊亂，如改變下丘腦氨基酸類神經遞質濃度、減少肛殖距及間質細胞功能異常等[1-3]；但是，其造成雄性動物生殖疾病的分子機制尚未完全明確。近年來的研究熱點發現MAPKs信號轉導通路在正常的生理和疾病過程中均發揮至關重要的作用，如神經系統發育[4]、神經退行性病變、疼痛[5]及腦炎癥[6]等疾病。MAPK絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。MAPKs信號通路主要分為3大類，即細胞外信號調節激酶(ERKs)、c-Jun氨基末端激酶(JNKs)和P38激酶通路。MAPKs信號通路能被化學物質、氧化應激、細胞因子、神經遞質及激素等細胞內外的因素激活，發生磷酸化作用。短暫激活ERKs促進細胞生存和增殖，持續激活ERKs促進細胞的分化；而短暫激活JNKs促進細胞增殖和分化，持續激活促進細胞的凋亡；P38激活下游分子原癌基因c-myc與核因子-κB(NF-κB)，促進細胞死亡。激活的MAPKs通路促進氧化應激的發生、抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達、促進凋亡蛋白Bax表達，并刺激細胞色素C的釋放，最終上調Caspase-3、8、9，誘導細胞凋亡[7-9]。而關于炔雌醚對大鼠睪丸生精細胞MAPK信號傳導通路的影響尚未見報道，因此，本試驗將對有關MAPK信號傳導通路在炔雌醚誘發成年大鼠生精異常過程中的作用進行研究，旨在揭示MAPK信號傳導通路在環境內分泌干擾物誘發生精異常的深層作用機制。

1材料與方法

1.1試驗動物處理

8周齡雄性封閉群SD大鼠(河南省實驗動物中心)。平均體重(240±20) g，自由采食、飲水，在每天14 h光照，10 h黑暗的條件下進行飼喂。將20只8周齡雄性SD大鼠隨機分為4組，適應飼養1周后，按體重分別以0.00、0.01、0.10、1.00 mg·kg-1腹腔注射溶解于橄欖油的炔雌醚，50 μL·只-1，每天1次，連續1周。

1.2試劑

炔雌醚購自北京紫竹藥業有限公司；橄欖油購自國藥集團；PCNA、TUNEL檢測試劑盒、磷酸化ERK、JNK、P38檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3TUNEL法檢測睪丸原位細胞凋亡

睪丸生精細胞凋亡檢測按試劑盒說明進行，步驟：切片常規脫蠟至水，蛋白酶K室溫孵育30 min后，PBS沖洗，擦干樣品周圍的PBS；3% H2O2室溫孵育30 min，PBS沖洗；滴加TUNEL反應混合液(DNA末端轉移酶與含dNTP混合液的反應液)，在濕盒中，37 ℃孵育60 min，PBS沖洗；滴加轉化劑POD(酶標記抗熒光素抗體)，37 ℃孵育30 min，PBS(pH7.4)沖洗；滴加DAB底物溶液孵育5 min左右，蘇木精復染，中性樹膠封片。

1.4免疫組織化學染色

采用免疫組織化學染色檢測PCNA、磷酸化ERK(p-ERK)、JNK(p-JNK)及P38(p-P38)表達。免疫組化 LAB 法染色步驟：石蠟切片常規二甲苯脫臘，梯度酒精入水；0.01 mol·L-1PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次5 min；將組織切片用100%甲醇配制的3% H2O2封閉，室溫下30 min；微波抗原修復10 min，取出后自然冷卻至室溫；0.01 mol·L-1PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次 10 min；5% 正常山羊血漿(用 0.01 mol·L-1PBS 配制)室溫下30 min；加入一抗兔抗 Caspase-3(1∶100)抗體，4 ℃ 孵育過夜；0.01 mol·L-1PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次5 min；生物素標記的山羊抗兔 IgG(1∶200，用 0.01 mol·L-1PBS 配制)，室溫孵育2 h；0.01 mol·L-1PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次 10 min；三抗，室溫下1.5～2.0 h；0.05 mol·L-1Tris-HCl buffer(pH 7.2)漂洗2次，10 min以上；DAB 孵育：0.05 mol·L-1Tris-HCl 配制0.05%的 DAB 孵育液，孵育 20 min；DAB 顯色：0.05% DAB/H2O2，呈色2～10 min；0.05 mol·L-1Tris-HCl buffer(pH 7.2)漂洗3次，每次 10 min；脫水，透明，封片。

分別設置陰性對照，對照組與試驗組同時按上述步驟處理，用 PBS代替一抗，其它步驟完全相同。上述所有孵育過程均在濕盒中進行。TUNEL檢測和免疫組織化學染色結果描述：弱陽性(淺棕色)和強陽性(深棕色)。TUNEL法檢測與免疫組織化學染色的陽性細胞統計分別在各組大鼠睪丸切片上進行，統計1 000個生精細胞(包括精原細胞、精母細胞、精子細胞和間質細胞)中陽性細胞數。

1.5數據統計

數據用SPSS18軟件包進行單因素方差分析(One Way ANOVA)，以“均值±標準差(Mean±SD)”表示，P<0.01為差異極顯著。

2結果

2.1炔雌醚對睪丸組織結構的影響

如圖1和表1顯示，與對照組相比，0.01、0.10 mg·kg-1炔雌醚組睪丸組織結構無明顯變化；曲細精管生精上皮充實，各級生精細胞數量多，排列整齊，緊密有序，管腔內有大量精子。1.00 mg·kg-1炔雌醚處理后，大鼠睪丸有一定程度的萎縮，但無統計學差異；較多曲細精管生精上皮生精細胞數量明顯下降，排列松散而紊亂，管腔內沒有或少見成熟的精子。

2.2炔雌醚對生精細胞增殖與凋亡的影響

如圖2和表1所示，PCNA表達呈棕黃色，分布在多種生精細胞的細胞核內。與對照組相比，0.01和0.10 mg·kg-1炔雌醚組PCNA陽性細胞數量無顯著變化。1.00 mg·kg-1炔雌醚組PCNA陽性細胞數量下降49.35%，差異極顯著(P<0.01)。TUNEL表達呈棕黃色，分布在凋亡生精細胞的細胞核內。對照組和0.01 mg·kg-1組TUNEL表達細胞數量較少，0.10 mg·kg-1組TUNEL表達細胞數量有增加趨勢，但不顯著。1.00 mg·kg-1炔雌醚組TUNEL陽性細胞數量顯著增加了120.68%(P<0.01)。

表1炔雌醚對大鼠睪丸重量、生精細胞增殖與凋亡的影響

Table 1Effects of quinestrol on weight of testes，proliferation and apoptosis of spermatogenic cell in rats

**P<0.01表示與對照組相比差異極顯著，下同。生精細胞的精原細胞、精母細胞、精子細胞和間質細胞的PCNA和TUNEL陽性細胞通過睪丸免疫組化切片的1 000個細胞進行統計

**P<0.01 compared with the control andP<0.01 were considered statistically significant.The same as below.The numbers of cells positive for PCNA and TUNEL were determined by counting 1 000 spermatogenic cells (spermatogonia，spermatocytes，sperm cells and Leydig cells) from ST cross-sections with immunohistochemistry staining

2.3炔雌醚對大鼠睪丸生精細胞p-ERK、p-JNK和p-P38 表達的影響

圖3和表2表明，在對照組、0.01和0.10 mg·kg-1炔雌醚組，磷酸化ERK(p-ERK)主要表達在精原細胞的細胞質和細胞核。與對照組相比，0.01和0.10 mg·kg-1炔雌醚組p-ERK表達細胞數量無顯著變化。1.00 mg·kg-1炔雌醚組p-ERK表達在精原細胞、精母細胞、精子細胞和間質細胞的細胞核。細胞數量下降了54.7%(P<0.01)。與對照組相比，各試驗組p-JNK表達在精原細胞的細胞核，呈增加趨勢，0.01和0.10 mg·kg-1炔雌醚組無統計學差異(P>0.05)。1.00 mg·kg-1炔雌醚組p-JNK在精原細胞、精母細胞、精子細胞和間質細胞的細胞核均有表達，表達細胞數量增加了44.74%(P<0.01)。與對照組相比，各試驗組p-P38表達呈增加趨勢，0.01和0.10 mg·kg-1炔雌醚組主要表達在細胞核，增加數量無統計學差異(P>0.05)。1.00 mg·kg-1炔雌醚組p-JNK在精原細胞、精母細胞、精子細胞和間質細胞的細胞核均有表達，表達細胞數量增加了81.6%(P<0.01)。

表2炔雌醚對大鼠睪丸生精細胞p-ERK、p-JNK和p-P38 表達的影響

Table 2Effects of quinestrol on p-ERK，p-JNK and p-P38 of spermatogenic cell in rats

生精細胞的精原細胞、精母細胞、精子細胞和間質細胞的p-ERK，p-JNK和p-P38 陽性表達通過在睪丸免疫組化切片的計數1 000個生精細胞中的陽性細胞數進行統計

The numbers of cells positive for p-ERK，p-JNK and p-P38 were determined by counting 1 000 spermatogenic cells (spermatogonia，spermatocytes，sperm cells and Leydig cells) from ST cross-sections with immunohistochemistry staining

3討論

化學合成藥物炔雌醚作為嚙齒類動物不育劑，廣泛地用于控制鼠類種群數量[11-12]。炔雌醚通過誘導氧化應激、抑制生精細胞增殖、促進凋亡蛋白表達及抑制生殖激素分泌等途徑抑制雄性生殖器官睪丸、附睪、精囊腺及前列腺發育，降低雄性生殖功能[13]。但是，環境內分泌干擾物造成雄性動物生殖疾病的分子機制仍有待于進一步探討。MAPKs信號轉導通路在正常的生理和疾病過程中均發揮重要的作用，短暫激活的ERKs促進細胞生存和增殖，持續的激活ERKs促進細胞的分化；而JNKs短暫激活促進細胞增殖和分化，持續的激活通過促進 P53、Bax、Fasl、TNF 及caspase-3等促凋亡蛋白的表達，促進細胞凋亡；P38通過激活下游分子原癌基因c-myc表達、磷酸化 P53參與 Fas/Fasl 介導的凋亡、激活 c-jun 和 c-fos表達，誘導 Bax 轉位以及增強 TNF-α表達等多種途徑促進細胞死亡。而且，MAPK通路中的3個成員ERK1/2、JNK和 P38通路均參與調節包括睪酮和雌二醇在內的多種生殖激素合成[14-16]，而激素合成在生精細胞的發育與增殖過程中發揮關鍵的作用，因此，MAPK通路可能與激素水平異常造成的生殖疾病密切相關。

本研究結果顯示，7 d連續炔雌醚暴露造成大鼠睪丸組織結構紊亂，表達PCNA的生精細胞數量減少；同時，表達磷酸化ERK蛋白的生精細胞數量明顯下降。B.Wang等[17]發現，HSP90抑制劑17-去甲氧基-17-烯丙基氨基格爾德霉素(17-AAG)通過抑制ERK，增強棉酚對Bcl-2表達的抑制。前期研究發現炔雌醚處理抑制生精細胞Bcl-2的表達，而ERK磷酸化的抑制可下調Bcl-2的表達，表明炔雌醚可能通過抑制ERK的磷酸化減少細胞增殖[10，18]。柳海燕等[19]通過激活ERK MAPK途徑來調節3B-羥基類固醇脫氫酶(3B-HSD)，進而促進睪酮的合成。A.Santillo等[20]采用D-天冬氨酸激活大鼠精原細胞ERK磷酸化，上調雄激素受體表達，促進睪酮合成與分泌。前期研究發現，炔雌醚處理造成睪丸睪酮激素分泌的下降，因此，炔雌醚很可能通過抑制ERK MAPK途徑阻礙睪丸睪酮激素的分泌，而睪酮的下降又進一步影響性激素依賴的睪丸、附睪、精囊腺及前列腺發育，并促進生精細胞的凋亡。與PCNA表達相反，TUNEL陽性細胞數量顯著增加；同時，與ERK的磷酸化下降不同，JNK與P38的磷酸化均顯著升高。前期研究發現炔雌醚促進Bax、Fas/FasL及P53的表達，表明炔雌醚通過激活JNK與P38的磷酸化促進凋亡蛋白表達，誘導生精細胞凋亡。J.Liu等[21]發現，棕櫚酸通過激活ROS氧化應激、JNK及P38 MAPK信號通路促進心肌細胞自噬和凋亡。S.Qi等[22]研究證實，雙酚A通過激活JNK和P38 MPAK信號通路，激活Fas/FasL系統促進睪丸支持細胞的凋亡。因此，炔雌醚通過直接抑制ERK MAPK途徑、激活JNK和P38 MAPK途徑抑制細胞增殖、促進細胞凋亡；而睪酮含量下降又間接抑制睪丸發育，最終促進生精細胞的凋亡。

綜上表明，本研究通過炔雌醚處理大鼠試驗探討炔雌醚對睪丸MAPK信號通路的作用，初步論證MAPK在大鼠睪丸生精細胞凋亡中的作用。首次發現炔雌醚通過抑制ERK磷酸化降低PCNA的表達，從而抑制生精細胞增殖；并通過激活JNK和P38磷酸化增加TUNEL的表達，從而促進生精細胞凋亡。對生殖系統的MAPK信號通路進行深入的研究，有利于揭示生殖系統疾病的深層病理機制，從而為其防治尋找新的治療途徑提供參考。

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(編輯程金華)

The Role of MAPK Signaling Pathway in Quinestrol-induced Apoptosis of Spermatogenic Cells in Rat

LI Jian1*，CHEN Yao-xing2，CHEN Fu-ning3，WANG Zi-xu2，CAO Jing2，DONG Yu-lan2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang471003，China；2.LaboratoryofVeterinaryAnatomy，CollegeofVeterinaryMedicine，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China；3.ChangpingHospitalofIntegratedChineseandWesternMedicine，Changping，Beijing102208，China)

Key words:MAPK signaling pathway；PCNA；quinestrol；spermatogenic cells；apoptosis

Abstract:This experiment was conducted to study the role of MAPK signaling pathway in quinestrol-induced apoptosis of spermatogenic cells in rat.Twenty 8-week-old male SD rats were randomly divided into 4 groups and were treated by using daily intraperitoneal injection of 0.00，0.01，0.10 and 1.00 mg·kg-1of BW quinestrol dissolved in olive oil for 1 week after 1-week adaptive feeding.At the end of the treatment，the testis tissue sections were prepared and the morphology of the testis tissue was observed by HE staining.The immunohistochemistry staining was performed to measure the expression levels of PCNA，MAPK signaling pathway of p-ERK，p-JNK and p-P38 in spermatogenic cells and TUNEL method was used to detect apoptosis of spermatogenic cells.The results showed that the epithelial thickness of rat seminiferous tube decreased as well as the number of spermatogenic cells decreased.Numerous spermatocytes and spermatids showed swelling or shrinkage and meanwhile the number of mature sperm reduced in the lumen after quinestrol exposure.The expressions of PCNA and p-ERK in the spermatogenic cells were significantly decreased.In contrast，the expressions of TUNEL，p-JNK protein and p-P38 protein were significantly increased.The results suggest that quinestrol exposure inhibited the development of rat testis by inhibiting proliferation and promoting MAPK-mediated apoptosis of spermatogenic cells.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.023

收稿日期：2015-09-08

基金項目：河南省教育廳高等學校重點科研項目基礎研究計劃(16A230004)；河南科技大學青年科學基金項目(2015QN032)；國家級大學生創新創業訓練計劃項目(201310464065)

作者簡介：李健(1980-)，男，安徽亳州人，博士，副教授，主要從事生殖毒理學、動物解剖學與組織胚胎學教學與研究 *通信作者：李健，E-mail：lijian800702@126.com

中圖分類號：S865.1+2.3

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)02-0381-07