HBV X蛋白與非編碼RNA在HBV相關性肝癌進程中相關性的研究進展

孫子軍綜述，何　松審校（重慶醫科大學附屬第二醫院，重慶400010）

HBV X蛋白與非編碼RNA在HBV相關性肝癌進程中相關性的研究進展

孫子軍綜述，何松審校（重慶醫科大學附屬第二醫院，重慶400010）

肝炎病毒，乙型；病毒蛋白質類；肝腫瘤；RNA；綜述

原發性肝細胞肝癌（HCC）是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，全球每年大約有25萬新發的肝癌患者，有50萬～60萬人死于肝癌［1］。肝癌的形成涉及多個遺傳學及分子學的改變，雖然眾多的因素如酒精、濫用藥物、炎癥性肝病均可導致肝癌的形成，但乙型肝炎病毒（HBV）感染仍是導致肝癌形成的主要原因。全世界約有2.4億人感染HBV，HBV是一個不完全環狀雙鏈DNA，其包含4個開放讀碼框（ORF），分別編碼4種蛋白，即S、X、E、C蛋白。HBV中的X基因作為最小的一個ORF，編碼由154個氨基酸組成，相對分子質量為17×103的蛋白HBx［2-3］，HBx參與眾多重要的生物學過程，如細胞信號傳遞、周期進程、細胞增殖與凋亡等，在HCC的形成過程中起著重要作用。

之前普遍研究認為，基因調控主要依賴于蛋白編碼的RNA，非編碼RNA（ncRNAs）是細胞轉錄過程中的“噪聲”和機體的“廢物”，然而隨著基因測序技術的進步，越來越認為超過90%的基因參與非編碼RNA的轉錄，而僅有2%的基因能夠編碼蛋白質［4］。根據其大小，ncRNAs又可以分為2類：短鏈ncRNAs（small ncRNAs，sncRNAs，＜200 nt）和長鏈ncRNAs（long ncRNAs，lncRNAs，＞200nt）；sncRNAs包含微小 RNAs（miRNAs）、小干擾RNAs（siRNAs）及PIWI相互作用RNAs（piRNAs）。ncRNAs雖不編碼蛋白質，但其在表觀遺傳水平、轉錄及轉錄后水平調控基因的表達，廣泛參與了肝癌形成的病理生理過程。越來越多的研究證實，HBx與ncRNAs 在HCC的形成過程中相互作用、相互影響，共同參與肝癌的發生。HBx蛋白是一種多功能的調節蛋白，在細胞信號傳遞、HBV復制、周期進程、增殖及凋亡、蛋白降解、基因表達、表觀調控和遺傳穩定性等方面均有確切影響，廣泛參與HBV相關性HCC的發生及惡化。近年來，隨著人們對ncRNAs的深入研究，發現其在細胞周期進程、增殖及凋亡過程中同樣廣泛參與HCC的發展過程。本文將對HBx蛋白參與多種細胞信號通路、調控細胞周期、促進HBV復制、HCC的發生方面與ncRNAs的相關性作一綜述。

1　HBx參與多種細胞信號通路，調控HBV復制

HBx作為一種多功能蛋白，廣泛參與多種細胞信號通路、調控細胞周期、促進HBV復制和細胞增殖。在HBx轉基因小鼠肝臟中，IL-6/STAT3和Wnt/β-catenin信號通路被激活［5］，而在大鼠原代肝臟細胞轉染HBx后發現，HBx能夠促進G0期的肝臟細胞進入G1期。研究者同時認為，HBx能夠促進細胞由G0期進入G1期，并且阻礙細胞進入S期，與細胞中的三磷酸脫氧核糖核苷酸（dNTPs）有很大關聯［6］。前期對小鼠肝臟的研究發現，HBx能夠誘導p21和p27的表達，同時能夠激活G1期生長捕獲的MAPK信號通路，進而促進細胞周期和肝臟中HBV的復制［7］。近期研究發現，多種細胞信號通路參與了HBx促進細胞增殖過程，包括Ras/Raf/MEK/ERK、PI3K-Akt/PKB、JNK、Jak/STAT、NF-κB等［8-11］，在大鼠卵圓細胞中也發現了HBx通過激活MEK/ERK和PI3K/Akt/ PKB信號通路、上調細胞周期蛋白D1（cyclin D1）的表達、促進卵圓細胞增殖［12］。HBx激活p-ERK1/2信號通路與COX-2、5-LOX、Gi/o及PGE2、LTB4等之間的相互作用促進肝細胞增殖［13］。在原代小鼠肝臟細胞中，HBx通過下調p16表達，上調cyclin D、cyclinE、p21，使肝細胞從G0期進入G1期，并且停滯于G1期，同時HBx能夠上調p21的表達拮抗內源性p53基因沉默導致的細胞周期向S期推進，從而促進HBV的復制和細胞增殖。此外，NF-κB信號通路在HBV相關的HCC形成過程中起著重要作用，有研究證實，HBx通過NF-κB信號通路誘導細胞避免抗腫瘤藥物導致的細胞死亡，并伴隨著抗凋亡基因的上調［11］。可見，HBx可通過多種分子機制及信號通路參與HCC的形成過程。

2　HBx對肝臟損傷后再生的影響

有研究指出，在70%肝切除的HBx轉基因小鼠動物模型中，HBx表達能夠抑制肝臟的再生［14］。另一項研究結果則與之相反，在70%肝切除后的HBx轉基因小鼠相對于野生型小鼠細胞中p21穩定性下降，表明HBx能夠促進細胞提早進入細胞周期，促進肝再生［15］。但同時也發現在轉基因小鼠中，HBx的表達不會影響細胞凋亡、糖原合成及脂肪變性，對于肝再生過程中HBx推進細胞周期的具體細胞機制還不是很清楚。肝細胞生長因子（HGF）、IL-6和TNF-α［16］在肝切除后再生過程中發揮著重要的作用，HGF是肝臟再生的起始因子，IL-6能夠促進MAPK信號通路，而TNF-α能夠誘發IL-6表達，HBx轉基因小鼠在 DDC飼喂條件下發現，IL-6/ STAT3信號表達明顯增強，驗證了上述說法。經典的Wnt/ β-catenin信號通路在肝再生的過程中也發揮著重要的作用［17］，HCC中β-catenin突變體極為常見，在非HBV相關性肝癌中，異位表達的Wnt-1信號不能夠激活Wnt/ β-catenin信號通路，而在HBV感染引起的肝癌中，結果則相反，表明HBx對HCC中Wnt/β-catenin信號通路的激活是非常必要的［18］。在肝臟損傷后再生過程中，正常細胞會進行DNA修復，而在HBx轉基因小鼠中發現，肝細胞提早由G0期進入G1期，加快細胞周期進程，從而影響DNA損傷后修復。這些研究表明，HBx可以通過干預肝臟損傷后的再生過程，進而影響肝臟的修復及HCC的發生及進程。

3　lncRNA對肝臟損傷后再生的影響

有研究發現，lncRNA-an lncRNA associated with liver regeneration（lncRNA-LALR1，lncRNA-uc008aum）廣泛參與小鼠肝臟2/3切除（PH）后肝臟再生過程。在肝臟再生的過程當中，HGF上調，增加了lncRNA-LALR1的表達，且通過激活 Wnt/β-catenin信號通路，上調cyclin D1表達，加速肝細胞G1期進程，進而在體內外促進細胞周期進程和肝細胞增殖［19］。肝臟中5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）陽性指數結果表明，HBx轉基因小鼠在PH后較野生組達到峰值時間短，HBx可促進肝細胞提早進入S期［15］。有研究證實，上調lncRNA-LALR1表達，在PH后肝臟再生過程中G1/S期蛋白cyclin D1、cyclin E1、cyclin A2表達升高，而下調lncRNA-LALR1表達，結果則相反［19］。更加重要的是，lncRNA-LALR1參與包括Wnt/β-catenin、MAPK等多種信號通路來調控肝臟的增殖。BNL CL.2（小鼠胚胎干細胞）中lncRNA-LALR1水平明顯高于CCL-9.1（正常小鼠肝細胞系），同時2種細胞中，lncRNA-LALR1均能通過調控細胞周期促進肝細胞的增殖［4］。而在原代小鼠肝臟細胞中HBx能夠促進G0/G1進程［15］，調控肝細胞增殖，同時研究發現較低水平的HBx蛋白能夠激活MAPK信號通路，上調p21、p27的表達，抑制DNA的合成，而將HBx蛋白表達水平提高10倍，則發現p21、p27表達下調，G1期生長捕獲作用轉變為促進細胞增殖［20］。HBx蛋白在調整細胞增殖功能的復雜性是否與lncRNA-LALR1具有相關性及其可能的機制有待進一步研究。

4　sncRNAs對HBx相關性肝癌的影響

sncRNAs可以促進或抑制腫瘤生長。在肝癌中，普遍發現miR-221表達增加［21］，而HBV相關性肝癌中則發現miR-132表達下調，進一步研究則發現，在HepG2細胞中HBx通過促進miR-132甲基化進而抑制其表達［22］；與之類似，HBx能夠通過上調DNA甲基轉移酶3A （DNMT3A）引起miR-101異常甲基化，進而下調miR-101的表達［23］；近來研究則發現，在非腫瘤性的肝細胞中，HBx通過激活IL-6/STAT3信號通路，上調miR-21，而miR-21表達能夠使非腫瘤性的肝細胞獲得體外增殖和體內成瘤的能力［24］。有動物研究結果顯示，HBx可通過下調p53的表達，抑制miR-148a與啟動子的結合，從而使miR-148a在HBV相關肝癌中表達下降，有利于腫瘤的增殖和轉移［25］。此外，近來研究提示，HBx可通過影響miR-192、miR-548p轉錄過程，從而使二者在HBV相關性HCC中表達下調［26-27］。這些研究表明，HBx能夠調控miRNAs差異性表達，進而促進腫瘤的增殖和轉移。然而，從HBV感染到肝癌的發生是一個長期的過程，在HBV感染的早期階段，存在miRNAs參與HBx調控細胞周期進程、凋亡、增殖及DNA損傷后修復等過程，其具體的機制還需進一步研究證實。

5　lncRNA對HBx相關性肝癌的影響

最近的研究表明，lncRNA在人類疾病發展過程中同樣發揮著重要的作用。通常認為lncRNA長度大于200 nt，高度不保守，調控染色體修復、轉錄、轉錄后蛋白修飾、基因組印跡及蛋白功能調節［28-29］。在細胞的增殖、分化、周期、凋亡等生物學方面同樣觀察到lncRNA差異性表達。在分子功能學方面，lncRNA的作用主要分為以下4類：信號、誘導、指引和支持［30］。雖然目前已經闡明了lncRNA功能的主要分子機制，但是涉及具體的lncRNA生物學功能則研究甚少［31］。lncRNA參與各種生物學功能和病理變化，研究認為，lncRNA-BACE異常表達后能夠通過調節其抗原基因BACE1編碼的B-secretase蛋白，進而引起阿爾茨海默病，越來越多證據表明lncRNA表達與腫瘤相關。因此，lncRNA用于臨床診斷和治療腫瘤。近年來，越來越多證據表明lncRNA的表達與腫瘤相關。例如，lncRNA-metastasis-associated lung adenocarcinoma tran-script 1（MALAT1）與乳腺癌、肺癌、前列腺癌及肝癌的發生及轉移存在相關性［32］。在HCC的發生、轉移、預后及診斷等方面，lncRNA的研究逐漸成為熱點。例如，H19是一種公認的編碼長度為2.3 kb的lncRNA，特異性表達于母性等位基因，在生物體的生長和發育過程中發揮重要作用。在HBV相關性肝癌中，發現H19通過下調上皮細胞間質化（EMT）標記物鈣黏附蛋白E（E-cadherin，CDH1）、細胞角蛋白-8（cytokeratin-8，KRT-8）、cytokeratin-19（KRT-19）及緊密連接蛋白-1 （claudin-1，CLDN1）的表達，進而抑制肝癌的進程［33］。HBx作為HBV中重要的功能性調節蛋白，在肝癌的發生發展過程發揮重要作用。近來研究證實，HBx通過特異性調節腫瘤相關性lncRNA的表達促進肝癌的發生，Du等［34］在其研究中發現，在肝癌中lncRNA highly up-regulated in liver cancer（HULC）的表達水平與HBx呈正相關，進一步研究證實在肝細胞株LO2和肝癌細胞株HepG2中，HBx能夠通過抑制p18，上調lncRNA-HULC的表達，進而促進肝癌細胞的增殖。研究發現，HBx能夠下調lncRNA down-regulated expression by HBx（Dreh），而lncRNA-Dreh通過特異性結合波形蛋白，抑制HCC的轉移［35］。Huang等［36］發現一種新型與HBx相關的lncRNA DBH-AS1，檢測組織中lncRNA DBH-AS1的表達水平，提示其乙型肝炎表面抗原（HBsAg）及腫瘤組織大小呈正相關，進一步研究發現，IncRNA DBH-AS1的過量表達可誘導細胞周期G1/S和G2/M加速，其結果表明，HBx可誘導lncRNA DBH-AS1的表達，并且通過激活MAPK通路促進肝癌細胞的增殖和存活。HBx能夠特異性調控lncRNA，促進肝癌發生及轉移。然而，人體內HBV慢性感染往往遷延數十年，因此作者有理由相信在肝癌發生前，HBx已經通過調控lncRNA參與肝細胞惡化的各個過程，包括改變肝細胞正常的周期、增殖、凋亡等，最終發展為肝癌。

綜上所述，HBx能夠調控肝臟中多種ncRNAs的表達，同時也有多種ncRNAs參與HBx蛋白調控的肝臟周期、增殖及肝癌的形成過程，但現在對于HBx與ncRNAs二者之間具體的作用機制還不是很清楚，還有待進一步研究。

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（2016-02-01）