春石斛類原球莖克隆增殖技術研究

朱志國

蕪湖職業(yè)技術學院園林園藝學院，安徽蕪湖，241003

春石斛類原球莖克隆增殖技術研究

朱志國

蕪湖職業(yè)技術學院園林園藝學院，安徽蕪湖，241003

以春石斛(Dendrobiumnobile)莖尖誘導的無菌類原球莖作為外植體，在2/1 MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的NAA和6-BA，采用不同的培養(yǎng)方式和培養(yǎng)時間，設置不同的pH值等，對春石斛類原球莖克隆增殖技術進行了系統(tǒng)探討。結果顯示，采用1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1培養(yǎng)基配方對春石斛類原球莖克隆增殖效果最好。不同培養(yǎng)方式之間春石斛類原球莖增殖系數(shù)差異明顯，液體培養(yǎng)較固體培養(yǎng)、半固體培養(yǎng)效果好；液體培養(yǎng)中以液體振蕩培養(yǎng)，同時添加活性炭為最佳。試驗還表明，春石斛類原球莖的增殖率與培養(yǎng)時間成一定線性相關。經液體培養(yǎng)20 d，春石斛類原球莖數(shù)量增殖多，且沒有明顯的褐化現(xiàn)象，其中培養(yǎng)基pH值設為5.5最適宜。

春石斛；類原球莖；增殖

春石斛(Dendrobiumnobile)屬蘭科附生蘭，是花卉中名貴的花卉之一[1-2]，由于在春季開花，故名春石斛。春石斛一般采用類原球莖繁殖新個體，但增殖率低[3-4]，學界對類原球莖培育形成后如何克隆增殖的探討報道不多，采用液體培養(yǎng)進行克隆增殖的相關研究很少。本試驗采用春石斛培育形成的類原球莖為主要試材，研究植物生長調節(jié)物質種類及其濃度、培養(yǎng)方式等對春石斛克隆的效果，以探討春石斛類原球莖克隆增殖的最佳途徑，為規(guī)模化生產春石斛優(yōu)良種苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以分離的春石斛莖尖作為外植體培育形成的類原球莖。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同激素組合對春石斛類原球莖克隆增殖的影響

基本培養(yǎng)基為1/2 MS，NAA濃度設0、0.5、1.0、2.0 mg·L-1，分別添加6-BA 0.5、1.0 mg·L-1和KT 0.05、0.10、0.20、0.50 mg·L-1。每處理接種10瓶，每瓶接種15塊類原球莖。

以上材料培養(yǎng)45 d后進行克隆系數(shù)統(tǒng)計，以類原球莖增殖總數(shù)/接種類原球莖數(shù)計算[5-6]。

1.2.2 培養(yǎng)方式對春石斛類原球莖克隆增殖的影響

1.2.2.1 液體、半固體、固體培養(yǎng)方式比較

把誘導形成的類原球莖分別接種于添加7.0 g、3.5 g瓊脂的培養(yǎng)基和不添加瓊脂的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。每處理接種10瓶，每一瓶大約接種2.0 g類原球莖。

以上材料培養(yǎng)20 d后進行克隆系數(shù)統(tǒng)計，以類原球莖重量增加數(shù)/接種類原球莖重量計算。

1.2.2.2 液體振蕩、液體靜置、添加活性炭、不添加活性炭比較

將誘導形成的春石斛類原球莖分別進行振蕩、靜置培養(yǎng)、加入活性炭液體振蕩培養(yǎng)和加入活性炭液體靜置培養(yǎng)4種處理。培養(yǎng)基成分為1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1+6BA 0.5 mg·L-1。每處理接種10瓶，每一瓶接種大約2.0g類原球莖。

以上材料培養(yǎng)20 d后進行克隆系數(shù)統(tǒng)計，以類原球莖重量增加數(shù)/接種類原球重量計算。

1.2.3 培養(yǎng)時間對春石斛類原球莖克隆的影響

將春石斛類原球莖接種于液體培養(yǎng)基1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1+6BA 0.5 mg·L-1，添加活性炭振蕩培養(yǎng)。一共接種10瓶，每一瓶約接種2.0 g類原球莖，分別培養(yǎng)10、20、30 d后統(tǒng)計類原球莖重量，以類原球莖重量增加數(shù)/接種類原球莖重量計算。

1.2.4 培養(yǎng)基pH值對春石斛類原球莖克隆的影響

培養(yǎng)基滅菌前，pH值分別設為5.0、5.5、6.0、6.5，添加活性炭液體振蕩培養(yǎng)，每個處理10瓶，每瓶約2.0 g原球莖，14 d后統(tǒng)計類原球莖重量，計算克隆系數(shù)，以接種類原球莖重量增加數(shù)/接種類原球莖重量。

各處理均采用不添加瓊脂的1/2 MS培養(yǎng)基(激素組合和培養(yǎng)方式處理除外)，添加6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 1.0mg·L-1(激素處理除外)、3%的蔗糖、1.0 g·L-1活性炭(不同培養(yǎng)方式處理除外)。培養(yǎng)基pH調至5.5～6.0(pH值對照組除外)，各處理培養(yǎng)溫度設為(25±2)℃，光照時間14 h/d，光照強度40 μmol·s-1。采取Microsoft Excel和SPSS軟件進行數(shù)據統(tǒng)計與分析，多重對照用Duncan檢驗法。

2 結果與分析

2.1 激素組合對春石斛類原球莖克隆誘導的影響

激素配比對春石斛類原球莖克隆增殖的效果影響顯著。表1表明，3號處理的春石斛類原球莖克隆系數(shù)最高，1號處理次之，22號最低。其中，6-BA比KT的克隆效果好；當KT濃度大于0.1 mg·L-1時，春石斛類原球莖克隆系數(shù)明顯下降。當6-BA為0.5 mg·L-1時，NAA濃度控制在0～1.0 mg·L-1范圍內效果較好。類原球莖經20 d培養(yǎng)后，表面出現(xiàn)新的不規(guī)則狀凸起，進而發(fā)育形成新的類原球莖，實現(xiàn)了克隆增殖的目標。而原來的類原球莖則形成春石斛新個體。類原球莖克隆時切割不易過碎，不然會導致褐化壞死。另外，在培養(yǎng)基中添加適量活性炭對防止褐化有一定效果。

表1 不同激素組合對春石斛類原球莖克隆的影響

注：不同字母代表在0.05水平差異顯著。以下各表同。

2.2 培養(yǎng)方式對春石斛類原球莖克隆的影響

2.2.1 液體、半固體、固體培養(yǎng)對春石斛類原球莖克隆的影響

由表2可知，春石斛類原球莖采用液體、半固體、固體等方式進行培養(yǎng)，其克隆效果差異顯著。在不添加任何瓊脂的4種激素組合的培養(yǎng)基中，誘導形成類原球莖的時間均較短，形成的類原球莖數(shù)量多，類原球莖克隆系數(shù)大，最大可達4.21；培養(yǎng)基較硬的固體培養(yǎng)最差，克隆系數(shù)只有2.27，且質地硬，表面發(fā)綠；而介于液體與固體之間的半固體培養(yǎng)次之，但增殖狀況明顯比液體培養(yǎng)差。在液體培養(yǎng)的4種激素組合中，春石斛類原球莖克隆效果差異不顯著，但半固體誘導的類原球莖發(fā)育不夠健壯，顏色呈淡黃綠，有玻璃化現(xiàn)象，類原球莖質地也較硬。因此，在春石斛類原球莖克隆增殖過程中，采取液相和固相結合的方式進行培養(yǎng)較好，即先把外植體接種于不添加瓊脂的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，再轉接到添加瓊脂的培養(yǎng)基接著培養(yǎng)，誘導形成的類原球莖質量好，且培養(yǎng)周期短。

表2 液體、半固體、固體培養(yǎng)對春石斛類原球莖克隆的影響

2.2.2 液體靜置、液體振蕩培養(yǎng)對春石斛類原球莖克隆的影響

液體靜置培養(yǎng)與振蕩培養(yǎng)對春石斛類原球莖克隆的影響如表3所示。液體振蕩培養(yǎng)的增殖系數(shù)為1.82，數(shù)量多，晶瑩飽滿；而液體靜置培養(yǎng)只有0.73，且形成的類原球莖數(shù)量少，個小干癟，故液體振蕩培養(yǎng)比液體靜置培養(yǎng)明顯要好。添加活性炭可以吸附原球莖表面的褐化物質，一定程度上可增加原球莖數(shù)量，同時改變原球莖的質地，使原球莖更硬、更綠。

表3 液體靜置、振蕩培養(yǎng)

2.3 培養(yǎng)時間對春石斛類原球莖克隆的影響

培養(yǎng)時間對春石斛克隆的影響見表4。由表4可知，春石斛類原球莖克隆系數(shù)與液體培養(yǎng)時間成一定的線性相關。經過20 d培養(yǎng)后，春石斛類原球莖數(shù)量不斷增加，原球莖色澤呈黃綠，有少數(shù)原球莖褐化，晶瑩飽滿；但培養(yǎng)30 d后，春石斛類原球莖色澤泛黃，褐化程度越來越嚴重。因此，春石斛培養(yǎng)的時間不易太長，培養(yǎng)20 d較好，不僅能保證形成一定數(shù)量的類原球莖，還能避免褐化現(xiàn)象。

2.4 pH值對春石斛類原球莖克隆增殖的影響

pH值對春石斛類原球莖克隆的影響如表5所示。由表5可知，采取液體振蕩培養(yǎng)，pH值調節(jié)至5.5時，克隆增殖效果最佳，數(shù)量多，個體體積大；其次是pH值為6.0時，春石斛原球莖克隆數(shù)量多，但個體體積小；當pH值設為5.0時，效果最差，增殖系數(shù)只有1.31，產生的原球莖數(shù)量少，且個體體積小。

表4 培養(yǎng)時間對春石斛類原球莖克隆的影響

表5 pH值對春石斛類原球莖增殖的影響

3 結論與討論

石斛蘭組織培養(yǎng)技術早在20世紀60年代初國外就有不少研究[7-8]，并取得了一定的成效，不少品種還建立了快速繁殖體系。國內學界對春石斛的研究起步較晚，目前花卉市場上的春石斛大多數(shù)是引進日本等國的二、三代種苗[9-10]，經部分生產者通過多年的引種試種經驗，選育出了一些適合我國栽培的優(yōu)良品種，石斛蘭正作為一種產業(yè)在迅速發(fā)展。

不同品種的春石斛，其克隆增殖最適基本培養(yǎng)基不同，雖然1/2 MS、MS、M及VW等均可用于原球莖克隆增殖，但不同培養(yǎng)基增殖速度不同、品質差異很大，大多數(shù)研究選用MS作為基本培養(yǎng)基[11-12]，本試驗采用1/2 MS作為基本培養(yǎng)基，克隆效果較好。培養(yǎng)過程中，在添加不同的植物生長激素并改變激素濃度的情況下，春石斛類原球莖克隆增殖效果差異顯著。其中，采用NAA 1.00 mg·L-1+6-BA 0.50 mg·L-1組合，春石斛類原球莖克隆增殖效果最佳；KT沒有6-BA效果好；KT濃度大于0.1 mg·L-1，春石斛克隆增殖系數(shù)顯著下降；當6-BA 0.5 mg·L-1，NAA濃度控制在0～1.00 mg·L-1范圍內，效果較好。液體振蕩明顯比固體、半固體培養(yǎng)克隆增殖系數(shù)大，可能是因為液體培養(yǎng)基比固體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基通氣性好，而且液體振蕩培養(yǎng)時，類原球莖與培養(yǎng)基接觸面大，吸收營養(yǎng)成分充足[13]。春石斛類原球莖克隆增殖系數(shù)與培養(yǎng)時間成一定的線性相關，經過20 d培養(yǎng)后，原球莖數(shù)量不斷增大，褐化也變得嚴重，因此，誘導克隆培養(yǎng)時間不能太長，20 d即可，既能產生一定數(shù)量的原球莖新個體，又可克服褐化、污染等現(xiàn)象。同時，原球莖培養(yǎng)可以采用固相與液相相結合的培養(yǎng)方式培養(yǎng)[14-15]，即原球莖誘導在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而原球莖增殖采用液體振蕩培養(yǎng)，這種培養(yǎng)方法不僅能保證原球莖的重量，而且能保證原球莖增殖的速度。不同的pH值對春石斛克隆增殖的影響也不同，采用液體振蕩培養(yǎng)，pH值調節(jié)至5.5時，克隆增殖效果最佳，數(shù)量多，個體體積大。

[1]王偉，黃為昌，金荷仙，等．觀賞石斛蘭研究進展[J]．安徽農業(yè)科學，2009，37(2)：589-591

[2]Le Van T H,Takamura T,tanaka M.Callus formation and plant Generation from callus through somatic embryo structures in cymbidium orchid[J].Plant Science,2004,166(6):1443-1449

[3]王玉英，李枝林，余朝秀．春石斛試管增殖研究初報[J]．中國農學通報，2005，21(2)：208-209

[4]喬佳偉．春石斛栽培要點[J]．中國花卉園藝，2005(8)：18-20

[5]朱志國．影響百合試管鱗莖增殖因素的研究[J]．熱帶作物學報，2013，34(10)：1961-1965

[6]朱志國．金葉日本冬青組培增殖技術研究[J]．安徽科技學院學報，2011，25(6)：39-43

[7]Kim K K,Kunisaki J T,Sagawa Y.Shoot-tip culture of Dendrobium[J].Am Orchid Soc Bull,1970,39:1077-1080

[8]Morel G M.Producing virus-free cymbidiums[J].Am Orchid Soc Bull,1960,29:495-497

[9]毛碧增，李鳳玉，王春，等．春石斛組織培養(yǎng)技術研究[J]．浙江大學學報:理學版，2003，30(5)：580-583

[10]賈夢雪，徐瑾，葉香娟，等．春石斛優(yōu)良品種“森禾2006”組培快繁體系的建立[J]．植物生理學報，2013，49(12)：1363-1367

[11]何靜茹，李振堅，魯琳．春石斛離體快繁與瓶內開花[J]．廣東農業(yè)科學，2012，39(15)：33-38

[12]劉艷芬，劉貴巧，李振堅．春石斛規(guī)模化繁殖技術[J]．北方園藝，2006(6)：145-146

[13]中國科學院上海植物生理研究所細胞室譯．植物組織和細胞培養(yǎng)[M]．上海：上海科學技術出版社，1978：208

[14]張菊野，俞玲鳳，連宏坤．幾種影響春蘭原球莖生長與分化的因素[J]．植物生理學通訊，1993，29(3)：175-178

[15]張志勝，歐秀娟．墨蘭的組織培養(yǎng)[J]．園藝學報，1995，22(3)：303-304

(責任編輯：汪材印)

10.3969/j.issn.1673-2006.2016.08.034

2016-04-15

安徽高校省級自然科學重點研究項目基金(KJ2015A425)；安徽高校省級自然科學研究項目基金(KJ2012B219)；蕪湖職業(yè)技術學院校級科技創(chuàng)新團隊項目基金(Wzykj2016A02)。

朱志國(1976-)，安徽肥西人，碩士，教授，主要研究方向：觀賞植物繁育與栽培。

S567.239

A

1673-2006(2016)08-0124-04