高同型半胱氨酸血癥對大鼠頸總動脈平滑肌細胞增殖及Caspase-12蛋白表達的影響

周　磊，范茂丹，史承勇

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·論著·

高同型半胱氨酸血癥對大鼠頸總動脈平滑肌細胞增殖及Caspase-12蛋白表達的影響

周磊1，范茂丹1，史承勇2

[摘要]目的研究高同型半胱氨酸血癥對大鼠頸總動脈平滑肌細胞增殖及Caspase-12蛋白表達的影響。方法選取雄性SD大鼠40只，隨機數字表法分為4組，每組10只。分別以不同劑量蛋氨酸飲食喂飼12周后分離頸總動脈。HE染色觀察頸總動脈增殖情況；利用免疫熒光染色法觀察并測定頸總動脈內增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)表達情況；利用免疫組織化學染色法及蛋白免疫印跡法檢測Caspase-12蛋白表達情況。結果不同劑量蛋氨酸飲食導致大鼠頸總動脈不同程度增殖，頸總動脈內PCNA、Caspase-12蛋白表達增加，并呈濃度依賴性。結論高同型半胱氨酸血癥通過激活血管平滑肌細胞內質網應激反應導致Caspase-12蛋白表達增加，加重血管損傷，促進平滑肌細胞增殖，進一步加重動脈粥樣硬化。

[關鍵詞]同型半胱氨酸；平滑肌細胞；動脈粥樣硬化；Caspase-12

作者單位：1. 310002浙江杭州，南京軍區(qū)杭州療養(yǎng)院海勤療養(yǎng)區(qū)干部療養(yǎng)科；2. 310013浙江杭州，解放軍117醫(yī)院心血管內科

引用格式：周磊，范茂丹，史承勇.高同型半胱氨酸血癥對大鼠頸總動脈平滑肌細胞增殖及Caspase-12蛋白表達的影響[J].東南國防醫(yī)藥，2016,18(1):21-24，46.

同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是體內正常蛋氨酸循環(huán)產生的中間產物[1]。高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocystinemia, HHcy)是各種原因導致的蛋氨酸循環(huán)障礙，造成血漿中的Hcy水平>15 μmol/L[2]。近年來，大量研究發(fā)現，Hcy是一種反應性血管損傷氨基酸，HHcy與動脈粥樣硬化的形成發(fā)展密切相關[3]。血管平滑肌細胞的凋亡及異常增殖是動脈粥樣硬化形成的重要病理特征及主要發(fā)病過程。因此，本研究中利用喂飼SD大鼠不同劑量高蛋氨酸飲食建立高同型半胱氨酸血癥模型。在同一時間、同等條件下，利用免疫熒光染色法測定頸總動脈內增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)表達情況，評估頸總動脈平滑肌細胞增殖狀態(tài)；利用免疫組織化學染色法及蛋白免疫印跡法檢測Caspase-12蛋白表達情況，旨在明確HHcy對頸總動脈平滑肌細胞增殖的影響，為探究HHcy引起動脈粥樣硬化的發(fā)病機制提供線索。

1材料與方法

1.1實驗材料實驗動物：成年雄性SD大鼠40只，體質量(150±28)g，購于第二軍醫(yī)大學實驗動物中心，動物許可證號：SYXK(滬)2012-0003。建模過程中SD大鼠均清潔級飼養(yǎng)，定時喂食、喂水，室溫維持在22～24 ℃，每日8～22時光照。

實驗試劑： Dako Denmark A/S抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒、PCNA抗體(購于上海谷歌生物有限公司),Caspase-12抗體(購于美國Biovision公司),BSA(購于Roche公司),肝素、水合氯醛、多聚甲醛、1%鹽酸酒精、PBS液等。

1.2高同型半胱氨酸血癥模型的建立及Hcy濃度的測定隨機數字表法將40只SD大鼠分為4組，每組10只，各組大鼠鼠齡、體重均無顯著差異(P>0.05)。各組大鼠分別以不同劑量蛋氨酸飲食喂飼。對照組喂飼常規(guī)普通飼料，2%蛋氨酸組喂飼含2%蛋氨酸的高蛋氨酸飼料，4%蛋氨酸組喂飼含4%蛋氨酸的高蛋氨酸飼料，6%蛋氨酸組喂飼含6%蛋氨酸的高蛋氨酸飼料。各組大鼠分別于喂飼8、10、12周時抽取靜脈血，抗凝管收集，應用美國貝克曼庫爾特AU 680型全自動生化分析儀檢測血漿Hcy濃度，計算3次測量值的平均值代表各組實驗動物的血漿Hcy濃度。

1.3頸總動脈取材各組大鼠建模12周后取材：水合氯醛麻醉成功后將大鼠固定在操作臺上，常規(guī)備皮、消毒。取頸正中切口，鈍性分離皮下組織，暴露氣管，游離血管鞘，分離與左頸總動脈伴行的迷走神經，以動脈夾孤立頸總動脈后剪下。用含肝素的生理鹽水沖洗3遍，將分離的頸總動脈以4%多聚甲醛固定24 h后常規(guī)石蠟切片。

1.4HE染色觀察頸總動脈增殖將已固定并包埋的頸總動脈石蠟切片脫蠟，蘇木素染色5 min，流水沖洗后以1%鹽酸酒精分化30 s，分化滿意后流水沖洗。1%氨水溶液返藍30 s，滿意后伊紅染色3 min，充分脫水后中性樹膠封片。

1.5免疫熒光染色法測定PCNA表達將已固定并包埋的頸總動脈血管組織石蠟切片放入65 ℃的烘箱中烘片脫蠟，PBS液沖洗后置于EDTA緩沖液中微波修復，冷卻后置入3%過氧化氫溶液，室溫孵育10 min后5% BSA封閉20 min，滴加1:200稀釋的兔源抗鼠PCNA單克隆抗體，4 ℃過夜，次日PBS液洗凈后，每張切片中加100 μL熒光素標記驢抗兔IgG(Donkey Anti-rabbit/FITC抗體)，避光室溫下孵育1 h，PBS液洗凈后，每張切片中加入100 μL DAPI，避光細胞核染色5 min，用抗熒光淬滅封片劑封片，4 ℃下避光保存，用Bio-Red Radiance 2100型激光掃描共聚焦顯微鏡操作系統(tǒng)，氬離子激光系統(tǒng)掃描FITC標記的陽性反應物，陽性反應物經Laser Sharp2000軟件攝像分析。

1.6免疫組織化學染色法檢測Caspase-12蛋白表達將已固定并包埋的頸總動脈石蠟切片脫蠟至水洗，鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶免疫組織化學方法(SABC)檢測Caspase-12蛋白，兔源抗鼠Caspase-12多克隆抗體用5%BSA抗體稀釋液按1∶100稀釋，4 ℃過夜；二抗用5%BSA抗體稀釋液按1∶2000稀釋，DAB顯色后復染、脫水、透明、封片。在光鏡下觀察Caspase-12蛋白陽性顆粒。

1.7蛋白免疫印跡法檢測Caspase-12蛋白表達將備用的頸總動脈血管組織液氮預冷后研磨成粉，含1%蛋白酶抑制劑的組織裂解液裂解，12 000 r/min離心并收集總蛋白提取液，經轉膜、封閉、浸泡、搖床，加入兔源抗鼠Caspase-12多克隆抗體(用5%BSA抗體稀釋液按1∶1000稀釋)后4 ℃過夜，二抗(用5%BSA抗體稀釋液按1∶1000稀釋)搖床雜交2 h，加顯色劑避光顯色5 min，終止反應。將膠片掃描、存檔，凝膠成像分析儀分析處理，以β-actin作為內參，以Caspase-12/β-actin積分光密度值的比值表示Caspase-12蛋白相對表達水平。

2結果

2.1各實驗組血漿Hcy濃度各實驗組分別于喂飼8、10、12周時抽取靜脈血檢測Hcy濃度，結果提示在不同劑量高蛋氨酸飲食喂飼12周后，2%、4%及6%蛋氨酸組大鼠分別出現不同程度的高同型半胱氨酸血癥，見表1。

組別nHcy濃度(μmol/L)對照組207.22±1.202%蛋氨酸組1017.23±3.25*4%蛋氨酸組1022.45±1.65*6%蛋氨酸組1027.32±3.02* 注:與對照組比較,*P<0.05

A:對照組;B:2%蛋氨酸組;C:4%蛋氨酸組;D:6%蛋氨酸組圖1　各組頸總動脈結構(HE ×200)

2.2高同型半胱酸血癥對大鼠頸總動脈血管形態(tài)學的影響對照組大鼠頸總動脈壁各層結構完整，內膜光滑，中膜血管平滑肌細胞排列整齊有序。2%蛋氨酸組、4%蛋氨酸組及6%蛋氨酸組大鼠頸總動脈內膜增厚，內膜中平滑肌細胞出現不同程度的增殖，見圖1。

2.3高同型半胱酸血癥對大鼠頸總動脈血管壁PCNA表達的影響FITC免疫熒光染色后，頸總動脈中的PCNA呈現綠色信號。對照組大鼠頸總動脈內PCNA綠色信號較少，2%、4%、6%蛋氨酸組大鼠頸總動脈內PCNA綠色信號較對照組明顯增多，6%蛋氨酸組中PCNA綠色信號最多，見圖2。免疫熒光染色后，各組隨機選取10張圖片經Laser Sharp2000軟件分析后，行熒光強度測定和PCNA陽性細胞計數，結果見表2。

表2　各組頸總動脈血管壁PCNA表達熒光強度

A:對照組;B:2%蛋氨酸組;C:4%蛋氨酸組;D:6%蛋氨酸組圖2　各組頸總動脈血管壁PCNA表達(FITC ×200)

A:對照組;B:2%蛋氨酸組;C:4%蛋氨酸組;D:6%蛋氨酸組圖3　免疫組織化學染色法檢測Caspase-12蛋白(SABC ×400)

2.4高同型半胱酸血癥對大鼠頸總動脈血管壁Caspase-12蛋白表達的影響免疫組織化學染色后，Caspase-12蛋白呈棕黃色顆粒，光鏡下觀察各組頸總動脈血管組織切片發(fā)現， 對照組大鼠頸總動脈血管組織中Caspase-12蛋白陽性顆粒較2%蛋氨酸組、4%蛋氨酸組及6%蛋氨酸組稀疏，染色較淡，6%蛋氨酸組中頸總動脈血管組織中Caspase-12蛋白陽性顆粒最為致密，且染色較深，見圖3。

Western blot檢測各組頸總動脈內Caspase-12蛋白表達情況，結果發(fā)現，2%、4%、6%蛋氨酸組Caspase-12蛋白表達較對照組明顯增多，6%蛋氨酸組中Caspase-12蛋白表達最多，并且與Hcy呈濃度依賴性(P<0.05)，見圖4。

與對照組比較，*P<0.05圖4　Western blot檢測Caspase-12蛋白結果及表達

3討論

高同型半胱氨酸血癥是以血漿Hcy水平異常增高為特征的病理狀態(tài)[4-5]，是動脈粥樣硬化形成前的亞臨床狀態(tài)。異常增高的Hcy是引起動脈粥樣硬化的新的、獨立的、重要的危險因素[6-7]，可以視為高血壓、高血糖、脂代謝異常、吸煙等傳統(tǒng)危險因素之外的心血管病剩留危險因素。目前，Hcy對血管平滑肌細胞增殖的影響的實驗研究主要基于離體實驗，而離體細胞培養(yǎng)不能完全復制Hcy在體內的代謝及病理生理過程。本研究中，筆者利用喂飼高蛋氨酸飲食的方法，使2%蛋氨酸組、4%蛋氨酸組及6%蛋氨酸組大鼠在不同劑量高蛋氨酸飲食喂飼12周后，血漿中Hcy水平均處于不同程度高水平狀態(tài)(均>15 μmol/L)，因此，可以視為較理想、可靠的高同型半胱氨酸血癥動物模型。

周憲梁等[8]的研究發(fā)現，Hcy能夠促進平滑肌細胞cyclin D1的mRNA表達增加，通過細胞周期調控蛋白誘導平滑肌細胞進入分裂期，促進平滑肌細胞增殖，這與本研究的結果相似。本研究中，2%、4%及6%蛋氨酸組大鼠頸總動脈中PCNA表達較對照組明顯增多，提示Hcy對血管平滑肌細胞具有明顯的增殖效應。同時還發(fā)現，隨著Hcy水平升高，PCNA的表達也相應增多，說明Hcy并呈濃度依賴性刺激平滑肌細胞增殖。

血管平滑肌細胞的凋亡及異常增殖是動脈粥樣硬化形成的重要病理特征及主要發(fā)病過程。Caspase家族蛋白是一組半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，參與多種凋亡途徑介導的細胞凋亡[9-11]。Caspase-12蛋白定位于細胞內質網外膜，是介導內質網應激反應凋亡的關鍵酶，參與內質網應激反應特有的凋亡途徑[12-13]。有研究發(fā)現，Caspase-12過表達參與動脈粥樣硬化、糖尿病腎病、肝纖維化等多種疾病的發(fā)病過程[14-15]。本研究中，Caspase-12蛋白在各實驗組中均有表達，2%、4%及6%蛋氨酸組中Caspase-12蛋白表達水平較對照組明顯升高。此外，Western blot結果發(fā)現，2%、4%及6%蛋氨酸組中Caspase-12蛋白表達水平較對照組明顯升高，并且與Hcy呈濃度依賴性。以上實驗從細胞水平及分子水平均證明了Caspase-12蛋白表達升高與血漿Hcy水平升高有關，并且與Hcy呈濃度依賴性。目前國內外亦有研究發(fā)現，各種原因誘發(fā)的短時間的內質網應激反應具有維持細胞穩(wěn)態(tài)，促使細胞生存的作用[16]。過強的內質網應激反應超過自身調節(jié)能力，會引起細胞功能紊亂，最終導致細胞凋亡及異常增殖[17]。本研究結果提示長時間高濃度的Hcy刺激可能造成Caspase-12蛋白表達增加，破壞細胞穩(wěn)態(tài)，導致血管平滑肌細胞凋亡及異常增殖。

綜上所述，本實驗提示Caspase-12蛋白可能參與了HHcy引起的動脈粥樣硬化，Hcy可能激活細胞內質網應激反應，造成Caspase-12蛋白表達增加，進一步激活下游Caspase凋亡蛋白酶級聯反應，啟動平滑肌細胞凋亡，持續(xù)長時間的內質網應激反應最終造成細胞功能紊亂，加速細胞凋亡，使血管平滑肌細胞異常增殖，最終參與并促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。Caspase-12蛋白參與的內質網應激反應是Hcy導致動脈粥樣硬化可能的機制之一。

【參考文獻】

[1]中國高血壓防治指南修訂委員會. 中國高血壓防治指南2010 [J]. 中國醫(yī)學前沿雜志(電子版), 2011, 3(5): 42-93.

[2]王擁軍, 劉力生, 饒克勤, 等. 我國腦卒中預防策略思考:同時控制高血壓和高同型半胱氨酸水平[J]. 中華醫(yī)學雜志,2008, 88(47): 3316-3318.

[3]李燁, 寧清秀, 郭紅陽, 等. 同型半胱氨酸與冠心病合并2型糖尿病患者心功能的相關性分析[J]. 中華保健醫(yī)學雜志, 2013, 15(1): 34-36.

[4]李萍, 裴穎皓, 宮劍濱. 高同型半胱氨酸血癥對原發(fā)性高血壓患者左室重構的影響[J]. 東南國防醫(yī)藥, 2014, 16(3): 253-256.

[5]Zhong J, Wang J, Wang X, et a1. Significance of CAVI, hs-CRP and homocysteine in subclinical arteriosclerosis among a healthy population in China [J].Clin Invest Med, 2013, 36 (2): 81-86.

[6]Schaffer A., Verdoia M, Cassetti E, et al. Relationship between homocysteine and coronary artery disease. Results from a large prospective cohort study[J]. Thromb Res, 2014, 134(2): 288-293.

[7]吳平, 全亞萍, 陳順中. 2型糖尿病患者腦梗死與同型半胱氨酸的相關性研究[J]. 東南國防醫(yī)藥, 2013, 15(6): 559-591.

[8]周憲梁, 惠汝太, 劉力生, 等. 同型半胱氨酸對大鼠主動脈平滑肌細胞增殖及[J]. 中國分子心臟病學雜志, 2004, 4(4): 235-237.

[9]De MS, Candelaresi C, Agostinelli L, et al. Endoplasmic reticulum stress induces hepatic stellate cell apoptosis and contributes to fibrosis resolution[J]. Liver Int,2012,32(10):1574-1584.

[10]Liu Y, Wang J, Qi S Y, et al. Reduced endoplasmic reticulum stress might alter the course of heart failure via Caspase-12 and JNK pathways[J]. Can J Cardiol, 2014, 30(3):368-375.

[11]Lee HJ, Lee SH, Park SH, et al. Purification of catalytically active Caspase-12 and its biochemical characterization[J].Arch Biochem Biophys,2010,502(1):68-73.

[12]Xiao YJ, Huang W, Zhang JZ, et al. Increased plasma S-adenosylhomocysteine-accelerated atherosclerosis is associated with epigenetic regulation of endoplasmic reticulum stress in apoE-/-mice[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2015, 35(1): 60-70.

[13]Shohei S, Tsuyoshi C, Koichi K, et al. A deficiency of Herp, an endoplasmic reticulum stress protein, suppresses atherosclerosis in ApoE knockout mice by attenuating inflammatory responses[J]. PLoS One, 2013, 8(10): e75249.

[14]曹延萍, 郝詠梅, 劉青娟, 等. 內質網應激及其特有凋亡途徑Caspase-12與糖尿病大鼠腎組織固有細胞凋亡之間的關系[J]. 中國應用生理學雜志, 2011, 27(2): 236-240.

[15]Cameron SM, Anna JB, Mohammad IK, et al. Endoplasmic reticulum stress and glycogen synthase kinase-3β activation in apolipoprotein E-deficient mouse models of accelerated atherosclerosis[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2012, 32(1): 82-91.

[16]Tabas I. The role of endoplasmic reticulum stress in the progression of atherosclerosis[J]. Circ Res, 2010, 107(7): 839-850.

[17]Hotamisligils SH. Endoplasmic reticulum stress and atherosclerosis[J]. Nat Med, 2010, 16(4): 396-399.

(本文編輯：齊名；英文編輯：王建東)

Effect ofhyperhomocystinemia on the proliferation of rats common carotid artery vascular smooth muscle cells and expression of Caspase-12

ZHOULei1,FANMao-dan1,SHICheng-yong2

.1.DepartmentofConvalescent,NavalLogisticsBranchofHangzhouSanatorium,NanjingMilitaryCommand，Hangzhou,Zhejiang310002,China；2.DepartmentofCardiology, 117HospitalofPLA,Hangzhou,Zhejiang310013,China

[Abstract]ObjectiveTo test the effect of hyperhomocystinemia on the proliferation of rats carotid artery vascular smooth muscle cells and the expression of Caspase-12. MethodsForty male SD rats were divided into four groups randomly. The common carotid artery were separated after feeding with high methionine foods for three months and taken to HE staining for observing the proliferation of carotid arteries. The expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) was detected by immunofluorescence staining. The expression of Caspase-12 was tested by immunohistochemistry and Western blot. ResultsDifferent levels of methionine in the diet leaded to varying degrees of proliferation of common carotid artery smooth muscle cells and increased expression of PCNA and Caspase-12 in a dose-dependent manner. ConclusionHyperhomocysteinemia can lead to increased expression of Caspase-12, which aggravates vascular injury through activation of endoplasmic reticulum stress response, promotes smooth muscle cell proliferation and further leads to atherosclerosis.

[Key words]homocysteine; smooth muscle cell; atherosclerosis; Caspase-12

(收稿日期：2015-08-24；修回日期：2015-10-19)

通訊作者：史承勇，E-mail：3177318463@qq.com

[中圖分類號]R543

[文獻標志碼]A

doi：10.3969/j.issn.1672-271X.2016.01.006