β-細辛醚對皮質酮誘導原代培養星形膠質細胞凋亡的干預作用

高志影　榮　華　劉得水　董海影　興桂華　韓麗君　盧長方　趙春明　吳淑琴　張曉杰

(齊齊哈爾醫學院，黑龍江　齊齊哈爾　161006)

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β-細辛醚對皮質酮誘導原代培養星形膠質細胞凋亡的干預作用

高志影榮華劉得水董海影興桂華韓麗君盧長方趙春明吳淑琴張曉杰

(齊齊哈爾醫學院，黑龍江齊齊哈爾161006)

〔摘要〕目的探討石菖蒲有效成分β-細辛醚對皮質酮(CORT)誘導星形膠質細胞(AS)凋亡的干預作用。方法原代培養AS，經不同濃度β-細辛醚預處理后,加入CORT誘導AS損傷模型，采用MTT法檢測AS的細胞活力，利用流式細胞術Annexin-V/PI法檢測AS凋亡率，用實時定量RT-PCR技術檢測Bax和Bcl-2表達水平。結果CORT處理后，CORT組較空白對照組細胞活力低，凋亡率顯著增加，Bax表達上調，而Bcl-2表達下調(P<0.05)。與CORT組比較，β-細辛醚組細胞活力高，凋亡率低，Bax的表達下調，Bcl-2表達上調(P<0.05)。結論β-細辛醚對CORT誘導的CORT凋亡具有抑制作用，下調Bax表達和上調Bcl-2表達可能是其作用的機制之一。

〔關鍵詞〕β-細辛醚；皮質酮；星形膠質細胞；凋亡

第一作者：高志影(1986-)，女，研究實習員，主要從事神經精神疾病的病理學研究。

星形膠質細胞(AS)功能障礙可導致神經突觸可塑性的體內平衡機制被破壞，最終導致神經系統功能障礙。石菖蒲屬于醒腦開竅類中藥，有效部位主要集中在揮發油〔1〕，其有效成分β-細辛醚具有明顯的神經保護作用〔2,3〕。本實驗利用皮質酮(CORT)誘導原代培養AS損傷模型，以β-細辛醚進行實驗干預，進一步深入研究β-細辛醚的神經保護作用及可能機制，從而為β-細辛醚防治神經系統疾病提供有價值的實驗依據。

1材料與儀器

1.1實驗動物SPF級SD大鼠，購買于哈爾濱醫科大學實驗動物醫學部，許可證編號：SCXK(黑)2013-0001。經雌雄合籠獲得子代新生1～3 d SD乳鼠。

1.2藥品試劑β-細辛醚(天津一方科技有限公司)，DMEM/F12培養基(Hyclone公司)；AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)；PrimeScript RT reagent(TaKaRa公司)；引物設計和合成(生工生物工程有限公司)。

1.3儀器FACS Calibur流式細胞儀(BD公司)；ABI7300熒光定量PCR儀(ABI公司)。

1.4方法

1.4.1AS的原代培養新生1～3 d SD乳鼠，消毒，斷頸剝離海馬，冷磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液中剪碎，離心棄上清，消化15 min。加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基終止消化，過濾，離心棄上清。重新加入培養基，置于37℃含5% CO2的培養箱內培養。第9天時，置于恒溫搖床內振搖18 h，選取對數生長期細胞進行實驗。

1.4.2分組及處理按照不同的處理分為空白對照組、CORT組、CORT+β-細辛醚組(36 μmol/L、72 μmol/L、144 μmol/L)。將純化后的AS消化、離心后，接種，24 h后β-細辛醚組加入不同濃度的藥物，培養箱內培養4 h后，空白對照組加入培養基，其他4組分別加入含10 μmol/L CORT的DMEM/F12培養基，繼續培養，然后進行指標測定。

1.4.3MTT法檢測AS存活率AS細胞懸液100 μl接種量2×104，給藥組加入不同濃度、等體積的β-細辛醚和CORT，CORT組加入等體積含CORT的溶劑，空白對照組加入等體積溶劑，將培養板放至溫箱培養至所需時間，加入MTT 溶液，繼續培養4 h 后，離心棄上清，加入DMSO，測定光密度值，計算細胞存活率。β-細辛醚處理濃度及處理時間參見文獻〔4〕進行設制。

1.4.4Annexin-V/PI法檢測AS凋亡率檢測時吸棄培養皿中培養液，PBS溶液洗滌培養皿貼壁細胞后，用無EDTA的0.25%胰酶進行消化制備單細胞懸液，2 000 r/min離心5 min收集。用PBS溶液洗滌細胞2次，收集細胞；加入500 μl的Binding Buffer懸浮細胞；加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，加入5 μl PI，混勻；室溫、避光、反應5～15 min；進行流式細胞儀的觀察和檢測。

1.4.5RT-PCR檢測AS的Bcl-2和Bax mRNA表達采用TRIzol試劑提取總RNA，Nanodrop 2000分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 的含量、純度和完整性。 按PrimeScriptTM RT試劑盒說明書操作，逆轉錄合成cDNA。反轉錄反應條件：42℃，15 min進行反轉錄反應；85℃，5 s進行反轉錄酶失活反應；4℃，進行下一步操作。在ABI7300熒光定量PCR儀上進行PCR反應，采用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒。分別擴增Bax、Bcl-2和GAPDH，每樣本作2個復孔和3個無模板的陰性對照。通反應條件:第一步是預變性，95℃，30 s，1個循環。第二步是PCR反應，95℃，5 s；60℃，31 s，40個循環。反應結束后，使用Sequence Detection software version1.2.3軟件(Applied Biosystems公司)分析PCR過程各檢測樣本的Ct(Threshold cycle)值。通過溶解解曲線判斷PCR反應的特異性。

通過2-△△CT法計算目的基因的相對表達水平〔5〕，ΔΔCt=(Ct目的基因-CtGAPDH)-(Ct對照組-CtGAPDH)。Bax引物：正義，5'-AGA CAC CTG AGC TGA CCT TGG AG-3'；反義，5'-GTT GAA GTT GCC ATC AGC AAA CA-3'。Bcl-2引物：正義，5'-TGA ACC GGC ATC TGC ACA C-3'；反義，5'-CGT CTT CAG AGA CAG CCA GGA-3'。GAPDH引物：正義，5'-GGC ACA GTC AAG GCT GAG AAT G-3'；反義5'-ATG GTG GTG AAG ACG CCA GTA-3'。

1.5統計分析采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析、SNK檢驗。

2結果

2.1β-細辛醚對AS活力的影響經濃度為10 μmol/L的皮質酮處理0~96 h，CORT組細胞活力在48 h后逐漸下降(P<0.05)；給予不同劑量的β-細辛醚處理后細胞活力較單純CORT處理細胞活力高(P<0.05)，48~96 h內呈時效依賴關系，見圖1。

與CORT組比較：1)P<0.05圖1　β-細辛醚對AS活力的影響

2.2β-細辛醚對AS凋亡率的影響CORT組〔(30.88±4.17)%〕較空白對照組〔(7.54±1.78)%〕細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)。在CORT處理AS前4 h給予不同劑量的β-細辛醚的藥物組，細胞凋亡率〔CORT+β-細辛醚36、72、144 μmol/L組分別為(20.63±3.78)%、(16.43±4.01)%、(16.93±2.30)%〕，較CORT組顯著降低(P<0.05)。

2.3β-細辛醚對AS的Bax和Bcl-2 mRNA表達影響CORT組AS的Bax 2-ΔΔCt(5.53±0.82)顯著高于空白對照組(1.00±0.41)，CORT處理后AS的Bax mRNA表達升高；CORT組AS的Bcl-2 2-ΔΔCt(0.20±0.05)明顯低于空白對照組(1.00±0.19)(P<0.05)；與CORT組相比，β-細辛醚各劑量組AS的Bax 2-ΔΔCt顯著減少(CORT+β-細辛醚36、72、144 μmol/L組分別為4.04±0.63,2.95±0.52,2.68±0.47)(P<0.05)，表明Bax mRNA表達顯著降低；β-細辛醚各劑量組AS的Bcl-2 2-ΔΔCt升高(CORT+β-細辛醚36、72、144 μmol/L組分別為0.73±0.15，0.66±0.12,0.63±0.10)(P<0.05)，表明Bcl-2 mRNA表達升高。

3討論

AS在中樞神經系統中扮演著重要的角色，對神經元的結構和代謝具有重要的調節作用。AS與突觸前和突觸后神經元共同構成“三重突觸”結構的概念，揭示了存在于神經元和AS之間信號轉導方式具有高度的可塑性及雙向性，AS功能異常是神經功能障礙的重要病理生理學機制之一〔6〕。

Bcl-2基因家族被認為是最重要凋亡相關基因，Bcl-2和Bax是其家族成員之一。他們的基因產物主要位于線粒體膜、核膜和內質網等處。Bcl-2能夠阻止生物氧化過程中的電子傳遞體細胞色素C從線粒體釋放到細胞質，從而抑制細胞凋亡；而Bax蛋白與Bcl-2蛋白可以形成異二聚體，從而抑制Bcl-2的抗凋亡作用〔7〕。因此認為Bax是極其重要的促細胞凋亡基因之一。研究表明，影響凋亡的關鍵因素取決于Bax/Bcl-2 兩蛋白之間的比例關系，若兩者比例失衡將誘導凋亡的發生〔8〕。

糖皮質激素(GC)是由腎上腺皮質中束狀帶分泌的一類甾體激素，應激時釋放以調節身體的穩態。然而，一旦GC代謝失調與認知功能障礙和情感障礙疾病密切相關，持續過度釋放會導致大腦海馬組織萎縮和抑制海馬神經再生〔9〕。CORT是糖皮質激素的一種，以劑量依賴的方式抑制大鼠大腦皮層AS的增殖〔10〕。

石菖蒲屬于醒腦開竅類中藥，有效部位主要集中在揮發油，β-細辛醚是揮發油的主要成分，被認為是其藥理作用的主要物質基礎，并有明顯的神經保護作用。近年來研究發現，β-細辛醚對β-淀粉樣蛋白誘導的PC12 細胞凋亡〔4〕。本研究推測β-細辛醚可能通過抑制促進凋亡蛋白Bax表達和上調凋亡抑制蛋白Bcl-2表達，使其比值達到相對平衡，減少AS的凋亡，從而發揮神經保護作用。

4參考文獻

1魏剛，方永奇，柯雪紅，等．石菖蒲開竅醒神物質基礎的藥學系列研究〔J〕.中國中醫藥信息雜志，2005;12(8)：51-3．

2Dong H，Gao Z，Rong H，etal．Beta-asarone reverses chronic unpredictable mild stress-induced depression-like behavior and promotes hippocampal neurogenesis in rats〔J〕.Molecules,2014;19(5)：5634-49．

3高志影，張春，董海影，等．石菖蒲有效成分對抑郁模型大鼠海馬神經元的保護作用〔J〕.中國老年學雜志，2014;4(34)：1000-2．

4Li C，Xing G，Dong M，etal.Beta-asarone protection against beta-amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells via JNK signaling and modulation of Bcl-2 family proteins〔J〕.Eur J Pharmacol,2010；635(1)：96-102.

5Adnan M，Morton G，Hadi S．Analysis of rpoS and bolA gene expression under various stress-induced environments in planktonic and biofilm phase using 2(-DeltaDeltaCT) method〔J〕.Mol Cell Biochem,2011;357 (1-2)：275-82．

6Alison J，Erik M．Astrocytes and synaptic plasticity〔J〕.Neuroscientist,2010;16(1)：40-50．

7Volkmann N，Marassi FM，Newmeyer DD，etal.The rheostat in the membrane:BCL-2 family proteins and apoptosis〔J〕.Cell Death Differ,2014;21(2)：206-15．

8Scarfo L，Ghia P．Reprogramming cell death:BCL2 family inhibition in hematological malignancies〔J〕.Immunol Lett,2013;155(1-2)：36-9．

9Mirescu C，Gould E．Stress and adult neurogenesis〔J〕.Hippocampus,2006;16(3)：233-8．

10Crossin KL，Tai MH，Krushel LA，etal.Glucocorticoid receptor pathways are involved in the inhibition of astrocyte proliferation〔J〕.Proc Nat Acad Sci U S A,1997;94(6)：2687-92．

〔2015-03-25修回〕

(編輯李相軍)

通訊作者：張曉杰(1965-)，女，教授，博士生導師，博士，主要從事神經精神疾病的病理學研究。

基金項目：黑龍江省自然科學基金項目(H201354)

〔中圖分類號〕R749.4

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)03-0566-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.022