普伐他汀對(duì)新生大鼠成骨細(xì)胞的作用研究

曾玉蘭 曾援

·實(shí)驗(yàn)研究·

普伐他汀對(duì)新生大鼠成骨細(xì)胞的作用研究

曾玉蘭 曾援

目的研究普伐他汀對(duì)新生大鼠成骨細(xì)胞的作用。方法用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽法(MTT)、4-硝基苯磷酸二鈉法(PNPP)、茜素紅染色法分別檢測(cè)普伐他汀對(duì)成骨細(xì)胞的活力,堿性磷酸酶(ALP)活力及骨礦化結(jié)節(jié)面積的作用。結(jié)果普伐他汀在10-8～10-4g/ml能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、提高成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性和促進(jìn)新生大鼠成骨細(xì)胞骨結(jié)節(jié)形成。結(jié)論普伐他汀能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化及礦化。

普伐他汀；成骨細(xì)胞；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽法；4-硝基苯磷酸二鈉法；堿性磷酸酶；骨結(jié)節(jié)

世界衛(wèi)生組織定義骨密度低于骨密度峰值的2.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差即為骨質(zhì)疏松癥［1,2］。骨質(zhì)疏松癥是以骨量低下,骨微結(jié)構(gòu)破壞,導(dǎo)致骨脆性增加,易發(fā)生骨折為特征的全身性代謝性骨病［3,4］。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率隨年齡的增加而增加且與雌激素水平有關(guān)［5］。流行病學(xué)研究表明,大多數(shù)骨質(zhì)疏松患者為絕經(jīng)期婦女,在發(fā)達(dá)國(guó)家中50歲以上婦女中約有50%的人存在骨質(zhì)疏松性骨折；隨著老齡人口的不斷增加,60歲以上骨質(zhì)疏松癥患者日益增加,約有25%的60歲以上婦女發(fā)生骨質(zhì)疏松癥,其中約44%有骨折危險(xiǎn)［6］。骨質(zhì)疏松性骨折帶來(lái)的慢性疼痛極大的影響了患者的生活質(zhì)量,骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題［7］。

骨是一個(gè)不斷經(jīng)歷著骨重建的動(dòng)態(tài)器官,成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在維持骨的動(dòng)態(tài)平衡中扮演著至關(guān)重要的角色［8,9］。在骨重建的過(guò)程中,首先發(fā)生的是破骨細(xì)胞骨吸收動(dòng)作,隨后成骨細(xì)胞在破骨凹陷處進(jìn)行骨形成活性,一個(gè)完整的周期內(nèi)骨形成的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于骨吸收時(shí)間,一旦被破骨細(xì)胞吸收骨質(zhì)形成的凹陷不能被形成的新骨填滿時(shí)將會(huì)發(fā)生負(fù)平衡,如果這種狀態(tài)持續(xù)發(fā)展,骨量丟失到一定程度時(shí),骨折的發(fā)生將不可避免［10,11］。骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的根本原因就是骨吸收作用與骨形成作用的平衡被打破,骨吸收大于骨形成。增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性能促進(jìn)骨基質(zhì)形成,促進(jìn)骨的礦化形成,增加骨密度［12,13］。因此,增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性是治療骨質(zhì)疏松的基本原則。研究表明,高血脂也是絕經(jīng)后婦女常見(jiàn)的并發(fā)癥,他汀類(lèi)藥物具有抗骨質(zhì)疏松作用已有報(bào)道［14］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究本醫(yī)院所購(gòu)買(mǎi)的他汀類(lèi)藥物普伐他汀是否對(duì)新生大鼠顱骨成骨細(xì)胞具有積極作用。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 新生SD大鼠選自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 成骨細(xì)胞的制備 取新生SD大鼠胎鼠(24 h內(nèi)),在無(wú)菌操作臺(tái)中取出顱骨,剔除骨頭上黏附的結(jié)締組織和血管,雙抗浸泡數(shù)分鐘后剪碎,用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA) 37℃水浴預(yù)消化后,棄上清保留骨片,骨片中加含0.1%Ⅰ型膠原酶37℃水浴消化15min后,取消化液離心10min,得到成骨細(xì)胞,重復(fù)上述膠原酶消化步驟,共消化6次,得到的細(xì)胞用10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)液置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),24 h換液,以后每隔2～3 d換液1次,傳代。

1.2.2 普伐他汀對(duì)新生大鼠成骨細(xì)胞增殖作用 細(xì)胞以3000個(gè)/孔細(xì)胞接種入96孔板,第1列為空白調(diào)零。細(xì)胞接種24 h后,加入不同濃度的普伐他汀,使終濃度分別是：10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/ml。加藥后分別作用24、48、72 h,實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h加20 μl的MTT(5mg/ml),繼續(xù)在37℃、5% CO2條件下孵育,隨后棄去培養(yǎng)液后加二甲基亞砜150 μl,振搖10min后于酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸光度,檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm,參考波長(zhǎng)630 nm。

1.2.3 普伐他汀對(duì)新生大鼠成骨細(xì)胞ALP活性的作用 細(xì)胞以3000個(gè)/孔的密度接種入96孔板中。24 h后加入不同濃度的普伐他汀,使終濃度分別是：10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/ml。測(cè)定藥物作用后第5、7、9天細(xì)胞的ALP含量。步驟簡(jiǎn)單描述如下,棄培養(yǎng)液,PBS沖洗,加入細(xì)胞裂解液50 μl,超聲裂解10min,加入含25 mmol/L二乙醇胺,1 mmol/L氯化鎂和6 mmol/L PNPP的反應(yīng)液100 μl,37℃放置30min,然后用0.1 mol/L的NaOH 50 μl終止反應(yīng),在酶標(biāo)儀于405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。樣品OD值在ALP標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取酶活性值(U/L)。

1.2.4 普伐他汀對(duì)新生大鼠成骨細(xì)胞骨結(jié)節(jié)形成的作用 采用維生素C和p-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)新生大鼠成骨細(xì)胞成熟礦化,普伐他汀5個(gè)濃度處理18 d后,取盡12孔板各孔培養(yǎng)上清液后,用PBS沖洗培養(yǎng)板2次,95%乙醇固定10min,用PBS再?zèng)_洗3次,各孔均加入0.1%茜素紅1ml,于37℃下放置30min,蒸餾水沖洗、甩干。于光鏡下觀察,以紅染、邊界清晰、短徑＞100 μm的標(biāo)準(zhǔn),于40倍光鏡下對(duì)各孔分別計(jì)數(shù),各孔均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 普伐他汀對(duì)新生大鼠成骨細(xì)胞增殖作用 成骨細(xì)胞增殖在決定新骨形成中起重要作用,普伐他汀濃度為10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/ml均能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。見(jiàn)表1,圖1。

2.2 普伐他汀對(duì)新生大鼠成骨細(xì)胞ALP活性的作用 ALP是反映成骨細(xì)胞分化早期活性的特異指標(biāo),ALP在成骨細(xì)胞分化早期處于一個(gè)上升的過(guò)程,在此過(guò)程中其表達(dá)的多少能反映出成骨細(xì)胞的分化程度和功能狀態(tài)。新生大鼠成骨細(xì)胞在普伐他汀不同濃度的刺激下,ALP活性顯著升高。見(jiàn)表2,圖2。

圖1 普伐他汀對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響

表1 普伐他汀對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖影響的OD值(±s,n=6)

表1 普伐他汀對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖影響的OD值(±s,n=6)

濃度 24 h 48 h 72 h對(duì)照 0.278±0.0304 0.335±0.0313 0.339±0.0061 10-8g/ml 0.351±0.0318 0.407±0.0234 0.415±0.0282 10-7g/ml 0.357±0.0319 0.412±0.0294 0.423±0.0363 10-6g/ml 0.360±0.0462 0.425±0.0221 0.446±0.0332 10-5g/ml 0.366±0.0148 0.446±0.0222 0.447±0.0194 10-4g/ml 0.282±0.0019 0.345±0.0053 0.349±0.0039

表2 普伐他汀對(duì)新生大鼠成骨細(xì)胞ALP活性影響的OD值(±s,n=6)

表2 普伐他汀對(duì)新生大鼠成骨細(xì)胞ALP活性影響的OD值(±s,n=6)

濃度 第3天 第5天 第7天對(duì)照 1.104±0.0522 1.015±0.0463 1.036±0.1148 10-8g/ml 1.475±0.0965 1.488±0.0823 1.603±0.0774 10-7g/ml 1.583±0.2006 1.588±0.0415 1.629±0.0923 10-6g/ml 1.651±0.2007 1.689±0.0487 1.714±0.0895 10-5g/ml 1.757±0.0704 1.779±0.0706 1.848±0.0431 10-4g/ml 1.018±0.0105 1.016±0.0181 1.015±0.0024

圖2 普伐他汀對(duì)新生大鼠成骨細(xì)胞ALP活性的影響

2.3 普伐他汀對(duì)新生大鼠成骨細(xì)胞骨結(jié)節(jié)形成的作用 在細(xì)胞外基質(zhì)礦化期,是以骨結(jié)節(jié)的形成及數(shù)量為特征。骨結(jié)節(jié)是分化成熟成骨細(xì)胞形成多層疊加的結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu),同時(shí)骨結(jié)節(jié)是衡量成骨細(xì)胞分化晚期活性的指標(biāo)。化合物在濃度為10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/ml作用20 d后,能夠影響新生大鼠成骨細(xì)胞骨結(jié)節(jié)形成。見(jiàn)圖3。

圖3 普伐他汀對(duì)成骨細(xì)胞骨礦化結(jié)節(jié)的影響

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是由多種原因引起的退行性骨骼疾病,以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致骨脆性增加易發(fā)生骨折為特征。促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化以及礦化是防治骨質(zhì)疏松的策略之一,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)細(xì)胞水平將普伐他汀作用于成骨細(xì)胞,研究其對(duì)成骨細(xì)胞的作用。

本實(shí)驗(yàn)選擇酶消化法來(lái)分離原代成骨細(xì)胞。酶消化法是指新生大鼠顱骨剪碎后,經(jīng)胰酶和Ⅰ型膠原酶在37℃水浴下反復(fù)消化5次,收集上清液在800 rpm離心10min后,取細(xì)胞沉淀接種于培養(yǎng)瓶中得到原代成骨細(xì)胞的方法。原代成骨細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h后更換培養(yǎng)基,去除未貼壁的成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞,待細(xì)胞長(zhǎng)滿至培養(yǎng)瓶底80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。此后通過(guò)換液和傳代不斷去除雜質(zhì)細(xì)胞,細(xì)胞傳至第3代時(shí),可得到純化的成骨細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：成骨細(xì)胞增殖在決定新骨形成中起重要作用,普伐他汀濃度為10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/ml均能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。ALP是反映成骨細(xì)胞分化早期活性的特異指標(biāo),ALP在成骨細(xì)胞分化早期處于一個(gè)上升的過(guò)程,在此過(guò)程中其表達(dá)的多少能反映出成骨細(xì)胞的分化程度和功能狀態(tài)。新生大鼠成骨細(xì)胞在普伐他汀不同濃度的刺激下,ALP活性顯著升高。在細(xì)胞外基質(zhì)礦化期是以骨結(jié)節(jié)的形成及數(shù)量為特征。骨結(jié)節(jié)是分化成熟成骨細(xì)胞形成多層疊加的結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu),同時(shí)骨結(jié)節(jié)是衡量成骨細(xì)胞分化晚期活性的指標(biāo)。化合物在濃度為10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/ml作用20 d后,能夠影響新生大鼠成骨細(xì)胞骨結(jié)節(jié)形成。

成骨細(xì)胞是骨形成過(guò)程中的重要功能細(xì)胞,它能夠表達(dá)很多種離子通道來(lái)促進(jìn)骨形成,同時(shí)在骨重建過(guò)程中能夠間接的調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞骨吸收過(guò)程,對(duì)骨重建、骨損傷修復(fù)起到了關(guān)鍵的作用［15］。成骨細(xì)胞增殖期細(xì)胞數(shù)量增加,在成骨分化早期成骨細(xì)胞表達(dá)ALP并釋放類(lèi)骨質(zhì)形成鈣化沉積,同時(shí)在骨形成過(guò)程中分泌的Ⅰ型膠原酶也能夠幫助礦化形成鈣化結(jié)節(jié)［16］。目前常將ALP和鈣化結(jié)節(jié)作為成骨細(xì)胞鑒定的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

綜上所述,普伐他汀在濃度為10-5、10-6、10-7、10-8g/ml提高成骨細(xì)胞的活力,促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖,在相同作用濃度下,成骨細(xì)胞ALP增高。但是其作用機(jī)制尚未闡明,有待于進(jìn)一步研究。

［1］Effendy NM,Shuid AN.Time and dose-dependent effects of Labisia pumila on bone oxidative status of postmenopausal osteoporosis rat model.Nutrients,2014,6(8):3288-3302.

［2］Makras P,Athanasakis K,Boubouchairopoulou N,et al.Cost-effective osteoporosis treatment thresholds in Greece.Osteoporos Int,2015,26(7):1949-1957.

［3］Alonso V,de Gortazar AR,Ardura JA,et al.Parathyroid hormone-related protein (107-139) increases human osteoblastic cell survival by activation of vascular endothelial growth factor receptor-2.J Cell Physiol,2008,217(3):717-727.

［4］Aras MH,Bozdag Z,Demir T,et al.Effects of low-level laser therapy on changes in inflammation and in the activity of osteoblasts in the expanded premaxillary suture in an ovariectomized rat model.Photomed Laser Surg,2015,33(3):136-144.

［6］Filip R,Possemiers S,Heyerick A,et al.Twelve-month consumption of a polyphenol extract from olive (Olea europaea) in a double blind,randomized trial increases serum total osteocalcin levels and improves serum lipid profiles in postmenopausal women with osteopenia.J Nutr Health Aging,2015,19(1):77-86.

［7］Cairoli E,Zhukouskaya VV,Eller-Vainicher C,et al.Perspectives on osteoporosis therapies.J Endocrinol Invest,2015,38(3):303-311.

［8］Adapala NS,Barbe MF,Langdon WY,et al.The loss of Cbl-phosphatidylinositol 3-kinase interaction perturbs RANKL-mediated signaling inhibiting bone resorption and promoting osteoclast survival.J Biol Chem,2010,285(47):36745-36758.

［9］Adapala NS,Barbe MF,Tsygankov AY,et al.Loss of Cbl-PI3K Interaction Enhances Osteoclast Survival due to p21-Ras Mediated PI3K Activation Independent of Cbl-b.J Cell Biochem,2014,115(7):1277-1289.

［10］Chen LL,Huang M,Tan JY,et al.PI3K/AKT pathway involvement in the osteogenic effects of osteoclast culture supernatants on preosteoblast cells.Tissue Eng Part A,2013,19(19-20):2226-2232.

［11］Amstrup AK,Sikjaer T,Mosekilde L,et al.Melatonin and the skeleton.Osteoporos Int,2013,24(12):2919-2927.

［12］Cao H,Yu S,Yao Z,et al.Activating transcription factor 4 regulates osteoclast differentiation in mice.J Clin Invest,2010,120(8):2755-2766.

［13］Chen Y,Gao H,Yin Q,et al.ER stress activating ATF4/CHOP-TNF-alpha signaling pathway contributes to alcohol-induced disruption of osteogenic lineage of multipotential mesenchymal stem cell.Cell Physiol Biochem,2013,32(3):743-754.

［14］Lin S,Huang J,Fu Z,et al.The effects of atorvastatin on the prevention of osteoporosis and dyslipidemia in the high-fat-fed ovariectomized rats.Calcified tissue international,2015,96(6):541-551.

［15］Chen J,Zhang H,Zhang X,et al.11 Mol Biol Epithelial sodium channel enhanced osteogenesis via cGMP/PKGII/ENaC signaling in rat osteoblast.Mol Biol Rep,2014,41(4):2161-2169.

［16］Chaturvedi R,Singha PK,Dey S.Water soluble bioactives of nacre mediate antioxidant activity and osteoblast differentiation.PLoS One,2013,8(12):1524-1528.

Research of effect by pravastatin for osteoblast in infant rats

ZENG Yu-lan,ZENG Yuan.Nanxiong City People’s Hospital,Nanxiong 512400,China

ObjectiveTo research effect by pravastatin for osteoblast in infant rats.Methods3-(4,5-dimethylthiahiazo-2)-2,5-phenytetrazoliumromide (MTT),4-nitrophenyl phosphate (PNPP) and alizarin red staining were applied respectively to detect activity of pravastatin for osteoblast,activity of alkaline phosphatase (ALP),and effect of bonemineralization nodule area.ResultsPravastatin in concentration of 10-8～10-4g/ml accelerated osteoblast multiplication,and improve activity of osteoblast ALP,and promote osteoblast bone nodule formation in infant rats.ConclusionPravastatin can accelerate multiplication,differentiation andmineralization in osteoblast.

Pravastatin; Osteoblast; 3-(4,5-dimethylthiahiazo-2)-2,5-phenytetrazoliumromide; 4-nitrophenyl phosphate; Alkaline phosphatase; Bone nodule

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.10.214

2016-02-02］

512400 南雄市人民醫(yī)院

曾援