三水白虎湯含藥血清抑制類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞遷移的臨床研究

何知廣 胡海平 伍敏生

三水白虎湯含藥血清抑制類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞遷移的臨床研究

何知廣 胡海平 伍敏生

目的探討三水白虎湯(SSBH)含藥血清抑制類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)滑膜成纖維細(xì)胞(FLS)遷移的臨床研究。方法利用組織塊培養(yǎng)法來(lái)收集RA滑膜FLS,并進(jìn)行體外傳代培養(yǎng),將20只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組與研究組,各10只。選取3-6代細(xì)胞分別加入對(duì)照組(生理鹽水制備的血清培養(yǎng))與研究組(SSBH含藥血清培養(yǎng)),在培養(yǎng)72 h后,提取細(xì)胞總蛋白,通過(guò)雙向凝膠電泳(2-DE)將細(xì)胞總蛋白進(jìn)行分離,利用凝膠經(jīng)銀染顯色與圖像數(shù)據(jù)來(lái)識(shí)別差異細(xì)胞蛋白的位點(diǎn),隨后對(duì)差異細(xì)胞蛋白的位點(diǎn)進(jìn)行鑒別。結(jié)果兩組滑膜成纖維細(xì)胞蛋白的雙向凝膠電泳圖譜都出現(xiàn)差異細(xì)胞蛋白質(zhì)點(diǎn),在差異蛋白表達(dá)量超過(guò)3倍的中蛋白質(zhì)點(diǎn)中選擇26個(gè)差異細(xì)胞蛋白質(zhì)點(diǎn)實(shí)施質(zhì)譜分析,總共鑒定出24種上升的白細(xì)胞介素-1(IL-1)受體拮抗蛋白。研究組SSBH 含藥血清對(duì) RA-FLS 分泌 IL-1、白細(xì)胞介素-2(IL-2)影響優(yōu)于對(duì)照組(P＜0.05)。結(jié)論SSBH可以通過(guò)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者FLS中的IL-1受體拮抗蛋白來(lái)抑制滑膜增生,同時(shí)也是治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的一種藥理機(jī)制。

三水白虎湯；類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；滑膜成纖維細(xì)胞

RA是一種常見(jiàn)的慢性疼痛性疾病,呈侵蝕性、進(jìn)行性發(fā)展,對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎若不及時(shí)治療,極易造成患者關(guān)節(jié)囊破損、關(guān)節(jié)軟骨,嚴(yán)重時(shí)還會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形,甚至出現(xiàn)關(guān)節(jié)功能障礙［1］。本文主要通過(guò)2-DE與質(zhì)譜技術(shù)有效分析SSBH含藥血清體外培養(yǎng)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞蛋白表達(dá)圖譜,尋找抑制FLS增生的靶點(diǎn),為類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療提供有效的參考依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取20只SPF級(jí)SD雄性大鼠為研究對(duì)象,平均體重(200±20)g,主要由醫(yī)科大實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證號(hào)SCXK：2012-0017)。滑膜組織主要來(lái)自南方醫(yī)院確診類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的膝關(guān)節(jié)。SSBH則由醫(yī)科大中醫(yī)院藥房提供［2］。

1.2 方法

1.2.1 SSBH含藥血清設(shè)備與老鼠分組 應(yīng)先進(jìn)行2次水煎SSBH,混合2次水煎進(jìn)行取液濃縮,濃度為含生藥2 g/ml,將大老鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(生理鹽水制備的血清培養(yǎng))與研究組(SSBH含藥血清培養(yǎng)),各10只。研究組給予2ml的SSBH灌胃,對(duì)照組給予等量的生理鹽水,持續(xù)給藥1周左右［3］。在進(jìn)行采血時(shí),前1 d晚上應(yīng)給大鼠禁食,不禁水,次日清晨末進(jìn)行給藥90min,隨后進(jìn)行動(dòng)脈采血,取血清。在56°的溫水中水浴30min滅活,0.22 μm除菌濾膜抽濾除菌,在-20℃溫度下進(jìn)行保存。

1.2.2 培養(yǎng)滑膜細(xì)胞原代 先將滑膜組織剪成1 mm3左右,將其平均排列在培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面,隨后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,并向瓶中添加20%的FBS培養(yǎng)液,將其放置在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；在4 h孵育后待組織塊貼附,將其培養(yǎng)瓶進(jìn)行翻轉(zhuǎn),平放,繼續(xù)培養(yǎng)；在3～4 d后可通過(guò)鏡下觀察組織塊旁邊的FLS是否成片生長(zhǎng),去除組織塊之后,再進(jìn)行培養(yǎng)；當(dāng)滑膜細(xì)胞覆蓋≥80%的培養(yǎng)瓶底面時(shí),進(jìn)行消化傳代。最后取3-6代的FLS進(jìn)行鑒定備用［4］。

1.2.3 抽提滑膜細(xì)胞總蛋白 將100 μl細(xì)胞裂解液加入到每個(gè)1.5×106滑膜細(xì)胞中,對(duì)其進(jìn)行吹打,使細(xì)胞和裂解液進(jìn)行接觸,放置1 h后,離心4℃ 40000 g,從中吸取上清液,為細(xì)胞總蛋白質(zhì),在-80℃中進(jìn)行保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 滑膜細(xì)胞總蛋白分離及染色 抽取蛋白樣品、上樣緩沖液,將兩者進(jìn)行混合,將其加入水化盤(pán)中,用鑷子除去IPG膠條上的保護(hù)層,把膠面朝下放置在水化盤(pán)樣品的溶液之上,1 h后利用礦物油進(jìn)行密封,在室溫的條件下密封16 h左右,隨后取出膠條,清除多余的液體,將膠條放置在聚焦槽中,加覆蓋礦物油,進(jìn)行第一向等電聚焦電泳。在聚焦后,取出膠條使其平衡15min,再進(jìn)行第二向SDS電泳,電泳結(jié)束后,取出凝膠利用銀染方法進(jìn)行顯色［5］。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察對(duì)比兩組差異蛋白及SSBH含藥血清對(duì)RA-FLS增殖的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組差異蛋白比較 兩組滑膜成纖維細(xì)胞蛋白的雙向凝膠電泳圖譜都出現(xiàn)差異細(xì)胞蛋白質(zhì)點(diǎn),在差異蛋白表達(dá)量超過(guò)3倍的中蛋白質(zhì)點(diǎn)中選擇26個(gè)差異細(xì)胞蛋白質(zhì)點(diǎn)實(shí)施質(zhì)譜分析,總共鑒定出24種上升的IL-1受體拮抗蛋白。研究組SSBH 含藥血清對(duì) RA-FLS 分泌 IL-1、IL-2 影響優(yōu)于對(duì)照組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 SSBH含藥血清對(duì)RA-FLS增殖的影響 SSBH含藥血清可呈劑量與時(shí)間依賴(lài)性抑制RA-FLS的增殖見(jiàn)表2。

表1 SSBH 含藥血清對(duì) RA-FLS 分泌 IL-1、IL-2 影響(±s,pg/ml)

表1 SSBH 含藥血清對(duì) RA-FLS 分泌 IL-1、IL-2 影響(±s,pg/ml)

注：與對(duì)照組比較,aP＜0.05

組別 只數(shù) IL-1 IL-2對(duì)照組 10 568.32±27.40 146.072±14.640研究組 10 502.21±12.43a 105.500±10.320a

表2 SSBH含藥血清對(duì)RA-FLS增殖的影響(±s)

表2 SSBH含藥血清對(duì)RA-FLS增殖的影響(±s)

項(xiàng)目 時(shí)間 10% 20% 30% RA-SSBH 24 h 0.1550±0.0700 0.1450±0.0140 0.1220±0.0070 48 h 0.1320±0.0300 0.1120±0.0030 0.1040±0.0200 72 h 0.1210±0.0040 0.1010±0.0012 0.1010±0.0013 RA-FLS 24 h 0.1440±0.0170 0.1260±0.0020 0.1230±0.0040 48 h 0.1310±0.0006 0.1150±0.0015 0.1150±0.0017 72 h 0.1300±0.0001 0.1550±0.0001 0.1040±0.0001

3 討論

蛋白質(zhì)SSBH技術(shù)為RA的臨床研究提供了一個(gè)新的技術(shù)平臺(tái)。目前,國(guó)內(nèi)外使用的2-DE技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血漿、滑膜組織、滑膜細(xì)胞蛋白質(zhì)等進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),RA中具有多種特異性的蛋白表達(dá)［6］。本研究將20%FBS培養(yǎng)液進(jìn)行72 h的培養(yǎng)后,可最大化抑制細(xì)胞增殖、降低滑膜細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞總蛋白的抽提,通過(guò)2-DE技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)分析SSBH含藥血清體外培養(yǎng)的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者FLS蛋白表達(dá)圖譜,利用生理鹽水對(duì)空白對(duì)照組的差異績(jī)效分析,尋找最佳作用的濃度與時(shí)間以及抑制滑膜細(xì)胞增殖的作用靶點(diǎn)。研究表明,兩組滑膜成纖維細(xì)胞蛋白的雙向凝膠電泳圖譜都出現(xiàn)差異細(xì)胞蛋白質(zhì)點(diǎn),在差異蛋白表達(dá)量超過(guò)3倍的中蛋白質(zhì)點(diǎn)中選擇26個(gè)差異細(xì)胞蛋白質(zhì)點(diǎn)實(shí)施質(zhì)譜分析,總共鑒定出24種上升的IL-1受體拮抗蛋白。

綜上所述,SSBH可以通過(guò)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者FLS中的IL-1受體拮抗蛋白來(lái)抑制滑膜的增生,同時(shí)也是治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的一種藥理機(jī)制。

［1］高燕,肖長(zhǎng)虹,潘超,等.三水白虎湯對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)組學(xué)影響.山東醫(yī)藥,2013,53(21):7-9.

［2］高燕,肖長(zhǎng)虹,潘超,等.三水白虎湯對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞增殖及IL-6、IL-17分泌的影響.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2013,33(10): 1385-1388.

［3］陳德超,肖長(zhǎng)虹,吳啟富,等.四甲基偶氮唑鹽法觀察三水白虎湯含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖的影響.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2013， 11(19):3669-3672.

［4］潘超,肖長(zhǎng)虹,高燕,等.噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)淘選三水白虎湯作用于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞的靶點(diǎn)研究.中國(guó)免疫學(xué)雜志,2014， 30(4):446-448.

［5］夏卿,馮小輝.中藥含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.河南中醫(yī),2014， 34(3):456-457.

［6］高華利,歐陽(yáng)桂林,黃新星,等.補(bǔ)腎強(qiáng)骨方含藥血清對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞增殖及PCNA和Bcl-2表達(dá)的影響.中國(guó)骨傷,2012,2(11):942-945.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.10.216

2016-02-25］

510150 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院藥學(xué)部(何知廣伍敏生)；中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院(胡海平)