MMP-2、MMP-9在膀胱移行細胞癌組織中的表達及其臨床意義

王碧玉，黃燕妮，羊文芳

(1.海南省農墾三亞醫院檢驗科，海南 三亞 572000；2.海南醫學院熱帶醫學與檢驗醫學院，海南 海口 570102；3.儋州市第一人民醫院檢驗科，海南 儋州 571700)

MMP-2、MMP-9在膀胱移行細胞癌組織中的表達及其臨床意義

王碧玉1，黃燕妮2，羊文芳3

(1.海南省農墾三亞醫院檢驗科，海南 三亞 572000；2.海南醫學院熱帶醫學與檢驗醫學院，海南 海口 570102；3.儋州市第一人民醫院檢驗科，海南 儋州 571700)

目的 觀察膀胱移行細胞癌組織中基質金屬蛋白酶2(MMP-2)和基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達情況，并探討其表達的臨床意義。方法選取海南省農墾三亞醫院2012年1月至2015年1月收治的30例膀胱移行細胞癌組織標本作為觀察組，另選取非膀胱腫瘤手術中切術的正常膀胱組織標本30例作為對照組，對所有標本黏膜中MMP-2、MMP-9的表達情況與表達強度通過免疫組化SP法聯合高清晰度彩色醫學圖文分析系統進行檢測，分析其表達的臨床意義。結果觀察組標本中的MMP-2、MMP-9的表達比對照組標本的表達明顯增高，差異均有統計學意義(P＜0.05)，且MMP-2、MMP-9在正常膀胱上皮呈陰性表達；觀察組標本中的MMP-2、MMP-9呈現高表達狀態，且表達強度隨著疾病分期、分級的增高而逐漸增高，差異均有統計學意義(P＜0.05)。結論在膀胱癌侵襲轉移過程中，存在MMP-2、MMP-9的參與，在膀胱移行細胞癌中MMP-2、MMP-9的表達對其預后判斷具有非常重要的參考價值。

膀胱移行細胞癌；基質金屬蛋白酶2；基質金屬蛋白酶9；表達

惡性腫瘤侵襲與轉移是惡性腫瘤主要的生物學特征之一，其由多步驟、多因素參與，過程極其復雜[1]。在腫瘤的浸潤與轉移過程中，細胞外基質具有非常重要的作用，其中腫瘤浸潤與轉移的前提是基底膜或細胞外基質的降解。原發腫瘤細胞通過激活細胞合成并分泌各種降解酶類，使基底膜或細胞外基質發生降解，進入到循環系統，然后對免疫系統的攻擊進行躲避，穿過脈管于繼發部位發生外滲，進而轉移灶得以形成。基質金屬蛋白酶(Matrix metallo-proteinases，MMPs)通過使細胞外基質發生降解，加快癌細胞浸潤周圍組織的速度，是使細胞外基質各種成分發生降解的關鍵酶[2-4]。其中MMP-2與MMP-9是兩種水解蛋白酶，主要參與細胞外基質與基底膜降解，在惡性腫瘤細胞的侵襲與轉移過程中起到關鍵性作用。本研究通過應用免疫組織化學方法對膀胱移行細胞癌中MMP-2與MMP-9的表達進行檢測，以探討兩者表達的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取海南省農墾三亞醫院2012年1月至2015年1月外科收治的30例行膀胱癌手術切除的組織標本作為觀察組，觀察組中男性24例，女性6例，年齡36～76歲，平均(52.3±6.7)歲；所有膀胱癌均為膀胱移行細胞癌，且術前都接受過不同方式的抗癌治療。將膀胱癌組織進行病理分級：其中10例為G1級，12例為G2級，8例為G3級。將膀胱癌組織進行TNM國際分期：其中12例為膀胱移行細胞癌Ⅰ期，10例為膀胱移行細胞癌Ⅱ期，8例為膀胱移行細胞癌Ⅲ期。另選取非膀胱腫瘤手術中切術的正常膀胱組織標本30例(均取自因良性前列腺增生癥行開放手術的患者)作為對照組，對照組中男性22例，女性8例。

1.2 方法

1.2.1 實驗材料 包括鼠抗人MMP-2單克隆抗體、MMP-9多克隆抗體，均采購自上海研生生化試劑有限公司；通用型SP二抗試劑盒及DAB顯色試劑盒均采購自上海魯汶生物科技有限公司。

1.2.2 實驗方法 標本固定采用40 g/L甲醛，固定后進行包埋，用石蠟包埋，然后進行切片，切片厚度為2 μm，于載玻片上進行安置。標本進行常規脫蠟至水洗，組織切片進行水化，用枸櫞酸鈉緩沖液進行抗原修復。為阻斷內源性過氧化物酶的活性，用3%過氧化氫去離子水進行孵育，時間30 min；山羊血清室溫下進行孵育，時間30 min；采用胰蛋白酶對MMP-2與MMP-9進行消化；采用微波對抗原進行熱修復；經磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后滴加50 μl一抗于4℃冰箱過夜，進行3次PBS洗滌，2 min/次。滴加二抗，用通用型SP試劑盒中生物素進行標記，孵育30 min，溫度為37℃，進行3次PBS洗滌，2 min/次；滴加50 μl鏈霉親和素-辣根過氧化物酶，置于37℃孵育30 min，PBS洗滌3次，一次2 min；用DAB進行顯色，溫度為室溫，DAB顯色用PBS進行終止；用清水沖洗10 min，進行復染，然后脫水、透明、封片與照相。陽性對照采用已知為陽性的乳腺癌病理切片的一抗染色，陰性對照用PBS代替一抗。MMP-2與MMP-9表達的陽性染色面積及陽性染色的強度采用HMIAS-2000型全自動彩色圖像分析系統進行分析，并用計算機計算積分光度與平均灰度。棕黃色或棕褐色是定位于細胞質的陽性著色。

1.3 統計學方法 MMP-2與MMP-9的相對含量以平均光密度值表示，計量數據以均數±標準差(±s)表示，均采用SPSS12.0統計學軟件包進行獨立樣本t檢驗，并進行Spearman等相關分析和直線相關分析，檢驗水準為α=0.05，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 膀胱移行細胞癌與正常膀胱組織中MMP-2與MMP-9的表達 在所有膀胱移行細胞癌組織中，MMP-2與MMP-9在腫瘤細胞與間質細胞均有不同程度的表達，其中主要表達為腫瘤細胞，表達較低者為間質細胞。觀察組中腫瘤細胞的胞漿內是MMP-2與MMP-9兩者表達的主要部位，呈顆粒狀，顏色為黃色至棕黃色，見圖1，圖2。本研究中MMP-2與MMP-9在所有正常膀胱組織中的表達均呈陰性。

圖1 MMP-2在膀胱癌中的表達

圖2 MMP-9在膀胱癌中的表達

2.2 膀胱移行細胞癌與正常膀胱組織中MMP-2與MMP-9平均光密度值比較 觀察組MMP-2平均光密度值為(0.257±0.031)，對照組為(0.201±0.020)，與對照組比較，觀察組MMP-2平均光密度值明顯提高，差異有統計學意義(t=6.311，P＜0.05)；觀察組 MMP-9平均光密度值為(0.248± 0.023)，對照組為(0.209±0.022)，與對照組比較，觀察組MMP-9平均光密度值明顯提高，差異有統計學意義(t=4.813，P＜0.05)。

2.3 不同分級膀胱移行細胞癌中MMP-2與MMP-9平均光密度值比較 隨著膀胱癌分級的增加，MMP-2與MMP-9在膀胱移行細胞癌組織中的表達增加，MMP-2與MMP-9的平均光密度值呈遞增趨勢。Spearman等級相關分析結果顯示，MMP-2與MMP-9平均光密度值都與膀胱癌分級呈正相關，相關系數分別為0.86，0.77，0.69(P均＜0.05)，見表1。

表1 不同分級膀胱移行細胞癌中MMP-2與MMP-9平均光密度值比較(±s)

表1 不同分級膀胱移行細胞癌中MMP-2與MMP-9平均光密度值比較(±s)

注：與G1級比較，aP＜0.05；與G2級比較，bP＜0.05。

組別 例數MMP-2MMP-9 G1級G2級G3級10 12 8 0.229±0.021 0.246±0.024ab0.285±0.037ab0.222±0.023 0.235±0.025ab0.273±0.036ab

2.4 不同分期膀胱移行細胞癌中MMP-2與MMP-9平均光密度值比較 隨著膀胱腫瘤分期的增高，MMP-2與MMP-9在膀胱移行細胞癌組織中的表達增加，MMP-2與MMP-9的平均光密度值呈遞增趨勢。Spearman等級相關分析結果顯示，MMP-2與MMP-9平均光密度值都與膀胱癌分期呈正相關，相關系數分別為0.747，0.648，0.603(P均＜0.05)，見表2。

表2 不同分期膀胱移行細胞癌中MMP-2與MMP-9平均光密度值比較(±s)

表2 不同分期膀胱移行細胞癌中MMP-2與MMP-9平均光密度值比較(±s)

注：與Ⅰ期比較，aP＜0.05；與Ⅱ期比較，bP＜0.05。

組別Ⅰ組Ⅱ期Ⅲ期例數12 10 8 MMP-2 0.226±0.020 0.243±0.023ab0.280±0.033abMMP-9 0.221±0.023 0.240±0.026ab0.281±0.031ab

2.5 膀胱移行細胞癌中MMP-2與MMP-9表達的相關性 經直線相關分析可知，MMP-2平均光密度值與MMP-9平均光密度值呈正相關(r=0.495，P＜0.05)。

3 討 論

臨床泌尿系統中，膀胱癌是最為常見的惡性腫瘤之一，其發病率及死亡率均占泌尿疾病首位，對膀胱癌進行早期診斷對治療與改善患者生存質量具有非常重要的作用。對膀胱癌進行早期診斷的常用方法包括尿脫落細胞學檢查及膀胱鏡檢查，但這些檢查方式均存在局限性，在膀胱癌早期診斷中，都無法成為的最理想的方法。近年來，關于有助于早期診斷膀胱癌的高度特異的生物學指標依然沒有找到。

MMPs是一組高度同源的參與基底膜與細胞外基質降解的蛋白酶類，到目前為止，已經發現了20余種，這些酶都具有相似的分子結構。構成MMPs超家族的MMPs各成員均具有特異的底物。MMPs種類繁多，但是具有以下幾種共性：(1)氨基酸序列及蛋白質結構具有相似性；(2)均可被其特異組織抑制因子TIMPs所抑制；(3)能夠同時降解多種細胞外基質成分；(4)都是以酶的形式被分泌出來。MMPs以什么種類、什么形式為主進行表達，主要與腫瘤的種類及惡性程度存在密切的關系。MMPs的功能主要包括：(1)對細胞粘著進行調節；(2)對細胞外基質末的有效成分進行降解；(3)作用于其他蛋白或者細胞外組分，進而啟動潛在的生物學功能；(4)參與胚胎發育的過程。有研究結果發現，在正常組織中，MMPs沒有表達，或僅有較弱水平的表達，與良性腫瘤及正常組織相比，MMPs在惡性腫瘤細胞中的表達明顯提高[5-6]。臨床上認為，MMP-2(明膠酶A)與MMP-9(明膠酶B)是與腫瘤浸潤與轉移關系最為密切的MMPs家族[7]。MMP-2與MMP-9都是以酶原的形式進行合成，兩種酶的激活主要發生在分泌出細胞的過程中，MMP-2與MMP-9的作用底物包括Ⅳ型膠原等各種成分，對靠近腫瘤表面的細胞外基質中的Ⅳ型膠原與明膠具有降解、破壞的作用，同時沿著缺失的基底膜，腫瘤細胞會浸潤周圍的組織，引發腫瘤的侵襲與轉移發生。另有研究發現，在血管的形成過程中，MMP-2與MMP-9發揮著非常重要的作用[8]。在MMP-2基因缺失的小鼠體內，血管的形成與腫瘤的生長會顯著性降低。MMP-9不僅能夠使VEGF的釋放得以促進，進而參與腫瘤血管的形成，并且能夠使成熟血管結構的形成得到促進，同時促進腫瘤的生長[9-10]。

本研究結果顯示，MMP-2與MMP-9在正常膀胱黏膜組織中呈陰性表達或表達較弱，這就表明MMP-2與MMP-9在正常膀胱組織中基本無酶活性。與正常膀胱組織比較，MMP-2與MMP-9在膀胱移行細胞癌中的表達明顯增強，這就表明，MMP-2與MMP-9的表達水平在膀胱癌的早期診斷中其重要的作用。本研究還顯示，與正常間質相比，MMP-2與MMP-9在腫瘤間質中的表達強度提高，且分布不均勻。這就表明腫瘤細胞產生的MMP-2與MMP-9蛋白隨著腫瘤的生長而越來愈多，使其穿透能力逐步增強，進而使腫瘤的轉移明顯加速[11]。本研究還發現，隨著膀胱癌分級與分期的增加，MMP-2與MMP-9在膀胱移行細胞癌組織中的表達增加，MMP-2與MMP-9的平均光密度值呈遞增趨勢。MMP-2與MMP-9平均光密度值都與膀胱癌分級、分期呈正相關，與研究結果較為一致[12-15]，這就表明在膀胱移行細胞癌分化過程中，癌組織中的MMP-9表達程度較高，尤其是浸潤肌層的癌組織中的MMP-9明顯高于局限在黏膜內的癌組織[16]。因此，本研究認為，MMP-2與MMP-9可以作為膀胱移行細胞癌早期診斷及患者預后的有效標志物。

綜上所述，在膀胱癌侵襲轉移過程中有MMP-2、MMP-9的參與，在膀胱移行細胞癌中MMP-2、MMP-9的表法對其預后判斷具有非常重要的參考價值。

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Expression of MMP-2,MMP-9 in human transitional cell carcinoma of bladder and their clinical significance.

WANG Bi-yu1,HUANG Yan-ni2,YANG Wen-fang2.1.Department of Clinical Laboratory,Hainan Provincial Nongken Sanya Hospital,Sanya 572000,Hainan,CHINA;2.College of Tropical Medicine and Laboratory Medicine,Hainan Medical University,Haikou 570102,Hainan,CHINA;3.Department of Clinical Laboratory,the First People's Hospital of Danzhou, Danzhou 571700,Hainan,CHINA

Objective To observe the expression of matrix metalloproteinases 2(MMP-2)and matrix metalloproteinase 9(MMP-9)in human transitional cell carcinoma of bladder and discuss the clinical significance.MethodsThirty tissue samples of transitional cell carcinoma of bladder were collected in Hainan Provincial Nongken Sanya Hospital from Jan.2012 to Jan.2015(the observation group).Another 30 cases of normal bladder tissues were selected as the control group.Immunohistochemical SP method and high-definition color medical graphic analysis system were used to detect the expression of MMP-2 and MMP-9.The clinical significance of the expression was analyzed.ResultsThe expression of MMP-2 and MMP-9 in the observation group was significantly higher than that in the control group(P＜0.05),and the expression of MMP-2 and MMP-9 in normal bladder epithelium were negative.In the observation group, MMP-2 and MMP-9 presents a high expression,and the expression strength increased gradually with the increase of the grade and stage of disease(P＜0.05).ConclusionMMP-2 and MMP-9 participate the process of invasion and metastasis of bladder cancer,and the expression of MMP-2 and MMP-9 in transitional cell carcinoma of bladder of provides important reference for the evaluation of the prognosis.

Transitional cell carcinoma of bladder;Matrix metalloproteinases 2(MMP-2);Matrix metalloproteinases 9(MMP-9);Expression

R737.14

A

1003—6350（2016）06—0877—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.06.006

2015-09-27)

黃燕妮。E-mail：6163162@qq.com