大腸癌和肝癌術后“異病同證”的代謝組學研究＊

魏 濱，呼雪慶，宋雅楠，李曉燕，蔡菲菲，季 青，，羅運權，王文海，蘇式兵＊＊

（1.上海中醫藥大學中醫復雜系統研究中心 上海 201203；2. 上海中醫藥大學中醫附屬曙光醫院上海 201203；3.上海市第七人民醫院 上海 200137）

大腸癌和肝癌術后“異病同證”的代謝組學研究＊

魏 濱1，呼雪慶1，宋雅楠1，李曉燕1，蔡菲菲1，季 青1，2，羅運權2，王文海3，蘇式兵1＊＊

（1.上海中醫藥大學中醫復雜系統研究中心 上海 201203；2. 上海中醫藥大學中醫附屬曙光醫院上海 201203；3.上海市第七人民醫院 上海 200137）

目的：本文主要探討大腸癌和肝癌術后肝腎陰虛證、脾虛證和濕熱證“異病同證”的血漿共同代謝物及其代謝機制。方法：對大腸癌和肝癌術后肝腎陰虛證、脾虛證、濕熱證和隱證的血漿代謝物譜進行代謝組學（GC-MS）檢測，采用主成分分析（PCA）方法尋找其“異病同證”的共同代謝物，并通過KEGG數據庫分析代謝通路。結果：大腸癌和肝癌術后肝腎陰虛證共同的代謝物是甘氨酸，尿素，色氨酸和丙氨酸，其代謝調控以氨基酸的降解為主；脾虛證共同的代謝物是甘氨酸、尿素、色氨酸、葡萄糖、賴氨酸和肌醇，氨基酸的降解和糖類的分解功能受到影響；濕熱證的共同代謝物是甘氨酸、尿素、色氨酸、葡萄糖、丙酸、甘露醇、山梨醇和賴氨酸，以影響糖類物質分解和供能過程為主要特征。結論：代謝組學方法是研究“異病同證”的有效工具之一。大腸癌、肝癌術后在肝腎陰虛證、脾虛證和濕熱證各有其共同的代謝物以及代謝機制。

大腸癌 肝癌 術后 證候 異病同證 代謝組學

大腸癌是常見的惡性腫瘤之一。目前手術是大腸癌主要治療方案，但手術后腫瘤復發和轉移率高達50%左右[1]。肝癌是世界范圍內第五大惡性腫瘤，發病率居惡性腫瘤第3位，每年肝癌死亡人數達20萬以上，死亡人數居惡性腫瘤第3位，新發肝癌病例中55%發生于中國[2-4]。肝癌的主要治療方法是手術切除，但是患者預后大多不佳。有些患者生存超過5年，大多數患者一年內復發，很快就會死亡[5，6]。中醫經歷數千年的發展，在惡性腫瘤治療領域自成體系，數千年的歷史檢驗說明中醫治療的合理性。中醫認識疾病、治療疾病、評價療效的基礎是證候[7]。現代中醫臨床實踐表明，在“病證結合”、“方證相應”、“辨證施治”的理論指導下，中醫藥治療惡性腫瘤等復雜難治性疾病具有明顯的特色優勢[8]。

代謝組學是一種高通量組學平臺，可獲得大量的數據信息，利用生物信息學技術和各種統計方法對數據進行處理，以尋找生物體代謝物變化的規律[9，10]。代謝組學是研究體內分子量1 000以內的小分子的內源性代謝物，如氨基酸、核酸和有機物等[11]。其主要研究的樣品有機體組織和機體分泌液如唾液、尿液等。代謝組學的分析技術平臺主要有：超高液相色譜法（Ultra High Performance Liquid Chromatography，UP-IC）、液相色譜（Liquid Chromat-Ogram，LC）、毛細管電泳一質譜聯用（Capillary Electro-Phoresis Mass Spectrometry，CE-MS）、和氣相色譜（Gas Chromatography，GC）等[11]。目前在各種腫瘤的診斷、治療、療效評價的方面廣泛應用代謝組學[12]。代謝組學把整個人體作為研究對象與中醫學的整體觀非常契合[13]。本研究采集肝癌、大腸癌術后患者樣本和中醫臨床證候信息，闡明中醫“異病同證”的代謝模式、代謝物及各病證的代謝機制，從機體代謝調控角度，為大腸癌和肝癌術后證候診斷及其代謝調控機制分析提供客觀的依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

氫氧化鈉、氯甲酸乙酯、吡啶、無水硫酸鈉和無水乙醇以上皆為分析純，L-2-氯苯丙氨酸購于上海瀛正科技有限公司；標準品尿素和對苯二甲酸購于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 實驗儀器

氣相色譜－質譜聯用儀（美國Agilent公司，型號： 6890/5975B）；微型漩渦混合器（美國Scientific Industries公司，型號：Vortex-Genie 2）；氣相毛細管色譜柱（美國Agilent公司，型號：DB-5 MS）；離心機（德國Eppendorf公司，型號：Centrifuge 5415R、Centrifuge 5702R）；數控超聲儀（昆山市超聲儀器有效公司，型號：KQ-250DB）。

1.3 方法

1.3.1 血樣采集及前處理

采取受試者的血樣，離心后分裝，置于-80℃冰箱保存待用。在實驗前2 h取出血漿樣品，在20℃下解凍，在12 000 rpm的轉速下離心10 min，取出上清液進行衍生化前的處理。使用兩步衍生化的方法，在吡啶和乙醇的催化作用下，血清經ECF的衍生，氯仿的萃取和無水硫酸鈉的干燥后，取出上清液待GC/ MS分析。

1.3.2 色譜-質譜（GC-MS）檢測

（1）色譜條件

進樣口溫度：280℃；進樣量：1.0 μL；不分流進樣，載氣：99.999%高純氦；流速：1.0 mL·min-1；口溫度：260℃；色譜柱：DB-5MS毛細管柱，色譜柱升溫程序見表1。

（2）質譜條件

離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：150 ℃；溶劑延遲：5 min；電子碰撞電離電壓：70 eV；質譜全掃描范圍（m/z）：30-550。

1.3.3 數據提取

原始數據經Agilent MSD工作站自帶軟件轉化為NetCDF格式后，導入R軟件采用XCMS工具箱＊＊ http://meltin.scripps.edu/download/處理。經基線校正，峰辨識等計算過程，導入Simca-P 11.5軟件進行多維統計分析，運用模式識別技術進行數據的可視化處理。

1.3.4 統計學方法

本實驗先采用非監督的主成分分析（PCA）來考察大腸癌和肝癌間總體代謝分布狀況，用來觀察各組間一般的聚集、分離和偏出。我們使用變量權重（VIP）大于1.5為閾值表示多維統計上的有意義的差異代謝物；VIP小于1為閾值表示多維統計上的有意義的共同代謝物。為了驗證多維統計結果，采用t檢驗，P＜0.05認為在單維上有統計學差異。在同時滿足VIP小于1和單維統計P＞0.05的代謝物，為有意義的共同代謝物。

1.4 研究對象

1.4.1 納入標準和排除標準

（1）納入標準

本研究納入對象是門診及住院的原發性肝癌（以下簡稱肝癌）和大腸癌手術后患者。肝癌患者為手術、介入或射頻等局部治療后理化檢查無轉移病灶者，有細胞學檢查或手術后病理學證實符合肝癌的臨床診斷標準[14]；大腸癌患者為手術后理化檢查無轉移病灶者，大腸癌診斷由手術后病理證實符合大腸癌臨床診斷標準[15]。病理診斷由上海中醫藥大學中醫附屬曙光醫院病理科醫生完成。患者年齡在18-75歲，男女不限，卡氏評分（Karnofsky）≥60分，預計生存3個月以上，并簽訂了知情同意書。

（2）排除標準:

排除標準為：①不符合納入標準者；②有嚴重心、腎、造血系統疾患及其它影響藥物評價因素者；③有精神障礙疾病者；④消化道梗阻者；⑤使用非本項目規定藥物者；⑥依從性差者。

表1 GC/MS色譜柱升溫程序

1.4.2 證候觀察和判別

證候觀察在收集患者樣本時通過望聞問切四診收集臨床信息。根據《中藥新藥臨床研究指導原則》，經兩位副主任或主任醫師辨證一致者，確定為4種證型：①肝腎陰虛證：脅肋疼痛、腰膝酸軟，潮熱、盜汗，口干咽燥、苔少或光剝，脈細；②脾虛證：腹脹納少、食后脹甚，肢體倦怠、神疲乏力、少氣懶言，形體消瘦、或肥胖浮腫，舌苔淡白；③濕熱證：發熱、身熱不揚，頭痛而重、身重而痛，口苦，胸痞，尿黃而短，舌質紅、舌苔黃膩，脈濡數；④隱證（無證可辨者）：患者無主訴，無明顯癥狀和體征。

2 結果

2.1 大腸癌和肝癌術后各證候代謝模式的比較

本文采用GC-MS代謝譜聯用技術，進行了大腸癌和肝癌術后患者（大腸癌術后肝腎陰虛證9例、脾虛證10例、濕熱證16例、隱證13例；肝癌術后肝腎陰虛證15例、脾虛證11例、濕熱證11例、隱證10例）和50例健康者的血漿代謝組的檢測，通過PCA方法分別對肝腎陰虛證、脾虛證、濕熱證和隱證建立模型，可以找到變量權重系數（VIP）小于1.0的共同代謝物。結果如圖1所示，大腸癌術后和肝癌術后在肝腎陰虛（圖1A）、脾虛證（圖1B）、濕熱證（圖1C）和隱證（圖1D）都不能明顯分離。

圖1 大腸癌術后和肝癌術后不同證候代謝模式的比較

2.2 異病同證代謝物分析

如表2所示，研究發現肝腎陰虛證在大腸癌和肝癌術后的共同代謝物是甘氨酸、尿素、L-色氨酸和丙氨酸，其中甘氨酸、尿素和色氨酸在大腸癌和肝癌術后的水平高于隱證；脾虛證在大腸癌和肝癌術后的共同代謝物是甘氨酸、尿素、葡萄糖、L-賴氨酸、肌醇和L-色氨酸，其中甘氨酸、尿素、肌醇的水平高于隱證，色氨酸的水平低于隱證；濕熱證在大腸癌和肝癌術后的共同代謝物是丙酸、甘氨酸、尿素、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、賴氨酸和L-色氨酸，其中在大腸癌、肝癌術后濕熱證中甘氨酸、尿素、葡萄糖、賴氨酸、山梨醇和甘露醇的水平高于隱證；隱證在大腸癌和肝癌術后的共同代謝物是甘氨酸、尿素、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和賴氨酸，其中甘氨酸、尿素、賴氨酸和甘露醇的水平高于健康者，色氨酸、葡萄糖和山梨醇的水平低于健康者。

表2 大腸癌和肝癌術后肝腎陰虛證、脾虛證、濕熱證和隱證的共同代謝物

圖2 肝癌和大腸癌術后各證型的代謝通路

大腸癌和肝癌術后各證候與隱證及隱證和健康者代謝物峰面積的比值表明，大腸癌和肝癌術后肝腎陰虛證的甘氨酸、尿素和色氨酸相較于隱證峰面積都是增加的。脾虛證的甘氨酸、尿素和肌醇相較于隱證峰面積都是增加的。濕熱證的甘氨酸、尿素、葡萄糖、山梨醇、賴氨酸和甘露醇相較于隱證峰面積都是增加的。隱證的甘氨酸、尿素、賴氨酸和甘露醇相較于健康者峰面積都是增加的，而色氨酸、葡萄糖和山梨醇相較于健康者峰面積都是減少的。雖然甘氨酸在肝腎陰虛證、脾虛證、濕熱證和隱證中都增加，但是肝腎陰虛證和脾虛證增加的幅度低于隱證增加的幅度，而濕熱證的高于隱證的。尿素在肝腎陰虛證、脾虛證和濕熱證中增加的幅度小于隱證增加的幅度。賴氨酸在濕熱證中增加的幅度大于隱證的。甘露醇在濕熱證中增加的幅度小于隱證增加的幅度。

2.3 代謝通路分析

本文根據上述的共同代謝物，分析了各證候的的代謝通路。如圖2所示共產生4個通路：①大腸癌和肝癌術后的濕熱證影響人體的糖代謝，并且以影響糖類物質分解和供能過程為主要特征（糖酵解和TCA是實現人體能量供給的重要通路），以及氨基酸的轉化和降解，嘌呤代謝也受到濕熱證的影響；②大腸癌和肝癌術后肝腎陰虛證擾動區域以氨基酸代謝為主，并且側重于氨基酸的降解；③大腸癌和肝癌術后脾虛證主要影響氨基酸的降解和糖類的分解功能；④大腸癌和肝癌術后隱證主要影響氨基酸的轉化和糖類的分解。

3 討論

在代謝組學應用于中醫證候的研究中，盧嫣等[16]發現，2-(羥基亞氨基)-丙酸、L-同型半胱氨酸、十六酸、二鳥嘌呤核苷四磷酸是腎系疾病中肝腎陰虛證的共同代謝物。陳磊等[17]在大鼠的脾虛證模型中發現較之正常組乳酸、牛磺酸、次黃嘌呤的含量升高，谷氨酸、鯊肌醇的含量降低。王穎等[18]在脾虛證的代謝組學研究中發現較之正常組，葡萄糖、丙氨酸、甘氨酸、脂類的含量下降，乳酸、蘇氨酸和谷氨酰胺的含量升高。趙鐵等[19]在強直性脊柱炎的濕熱證研究中發現較之正常組，α-羥基丁酸、磷酸和甘露糖血清中均明顯升高，而乙醇胺則明顯下。Li等[20]研究了小鼠氣虛血瘀模型的尿液代謝組學發現甲酸鹽、肌酐與正常組相比有明顯異常。Chen等[21]研究了GC-MS分析的探討腎陽虛證發現經氫化可的松造模后的腎陽虛模型組動物尿液的代謝譜圖與對照組相比發生明顯的差異。郭孜等[22]通過GC-MS分析發現乙肝后肝硬化患者不同中醫證候間的差異性尿代謝物與能量代謝和氨基酸代謝等通路相，其中在濕熱內蘊證與肝腎陰虛證之間存在支鏈氨基酸的差異。目前，越來越多的證據表明代謝組學在中醫證候的標志物的尋找方面扮演重要的角色，并且在中醫理論的指導下，代謝組學的方法可以用來評估臨床證候及鑒定潛在生物標志物[23，24]。但是，在大腸癌和肝癌術后的肝腎陰虛證、脾虛證、濕熱證和隱證中尚無代謝組學的研究。因此，本文利用代謝組學的方法對大腸癌和肝癌術后異病同證開展研究。

隱證是在臨床上沒有任何病理性特征的一類特殊的類型。本文在收集大腸癌和肝癌術后病例時，加入了隱證組作為篩選證候標志物時去除疾病的因素；在篩選證候的標志物時，與隱證的標志物取交集這樣就可以去除疾病的因素。這種利用隱證組來篩選證候標志物的方法在國內尚無人報道。

在大腸癌和肝癌術后的異病同證的代謝組學分析中發現肝腎陰虛證、脾虛證、濕熱證和隱證在大腸癌和肝癌術后的比較中可以區分，為了尋找大腸癌和肝癌術后異病同證的共同的特征代謝物，本文去除各個證型中PCA分析VIP值大于1的差異代謝物后，進一步分析發現，4個證候在大腸癌術后和肝癌術后的比較中不能區分。其中肝腎陰虛共同的代謝物是甘氨酸，尿素，色氨酸和丙氨酸；脾虛證共同的代謝物是甘氨酸、尿素、色氨酸、葡萄糖[25]、賴氨酸和肌醇；濕熱證的共同代謝物是甘氨酸、尿素、色氨酸、葡萄糖、丙酸、甘露醇[26]，山梨醇和賴氨酸；隱證的共同代謝物是甘氨酸、尿素、甘露醇、葡萄糖、山梨醇和賴氨酸。

比較其代謝通路可以發現，在大腸癌和肝癌術后的肝腎陰虛證擾動區域以氨基酸代謝為主，并且側重于氨基酸的降解；脾虛證中以氨基酸的降解[8]和糖類的分解功能受到影響；濕熱證影響人體的糖代謝[27]，并且以影響糖類物質分解和供能過程為主要特征（糖酵解和TCA是實現人體能量供給的重要通路），且氨基酸的轉化和降解，嘌呤代謝也受到濕熱證的影響；隱證中的代謝主要是氨基酸的轉化和糖類的分解。

本研究結果說明代謝組學方法是研究“異病同證”的有效工具之一。然而，研究僅采用了GC-MS方法，由于GC-MS比較適合于揮發性代謝物的檢測，對檢測的代謝物有一定的局限性。進一步的研究還可以采用LC-MS及核磁共振（Magnetic Resonance Image，MRI）等方法，開展非揮發性代謝物檢測及分析，將有助于發現更多的代謝物，更加有利于分析其特征代謝物及其代謝機制。目前，本研究尚未進一步定量驗證大腸癌和肝癌術后肝腎陰虛證、脾虛證、濕熱證和隱證差異代謝物，今后將進一步擴大樣本量，定量檢測其共同代謝物的含量，分析這些代謝物能否對辯證起到輔助診斷的作用。

由于中醫藥精準醫療是在中醫藥理論的指導下，應用基因組、蛋白組和代謝組等系統生物學技術、生物信息技術，大數據分析和挖掘技術等，結合患者生活環境和臨床數據和中醫“望、聞、問、切”四診信息，實現精準的病證分類和診斷，制定具有個性化的健康維護、疾病預防、診療和康復方案，并闡明其療效和安全性機制的新型中西醫結合醫療[28]。因此，以代謝組等組學技術為基礎探討大腸癌和肝癌術后患者的辨證施治個體化精準治療，揭示其證候的本質，為中醫的精確診斷和治療提供依據，是提高大腸癌和肝癌術后康復及轉移復發預防的研究課題之一。

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A Metabolomic Research on “The Same TCM Syndrome” in the Postoperative Patients with Liver Cancer and Colorectal Cancer

Wei Bin1, Hu Xueqing1, Song Yanan1, Li Xiaoyan1, Cai Feifei1, Ji Qing1,2, Luo Yunquan2, Wang Wenhai3, Su Shibing1
(1. Research Center for Traditional Chinese Medicine Complexity System, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai, 201203, China; 2. Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai, 201203, China; 3. The Seventh People's Hospital of Shanghai, Shanghai, 20013, China)

This study aimed to investigate the common metabolites in the same syndrome in traditional Chinese medicine (TCM) in postoperative patients with liver cancer (PLC) and colorectal cancer (PCC) underlying its metabolic mechanisms. Plasma metabolic profiles in PCC and PLC patients with liver- and kidney-yin deficiency syndrome (LKYDS)， spleen deficiency syndrome (SDS)， dampness heat syndrome (DHS) and latent syndrome (without any obvious TCM symptoms and signs) were detected using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The common metabolites of the same TCM syndrome in different diseases were identified via principal component analyses (PCA)， while the metabolic pathways were analyzed by means of KEGG database. As a result，glycine， urea， tryptophan and alanine were altered in the PCC and PLC patients with LKYDS and were involved in the degradation of amino acid; Glycine urea， lysine， tryptophan glucose and inositol were the metabolites in the patients with SDS and could affect the degradation and the decomposition process of amino acids and sugars; Glycine glucose， urea， acid tryptophan， sorbitol and mannitollysine were the common metabolites in the patients with DHS and influenced the process of carbohydrates’ decomposition and energy supply. It was conclusion that metabolomics was effective on exploring the material basis of the “same syndrome in different diseases” in TCM. The PCC and PLC patients shared some altered metabolites in the same TCM syndrome.

Liver cancer， colorectal cancer， postoperation， the same TCM syndrome in different diseases， TCM syndrome， metabolomics

10.11842/wst.2016.09.012

R2-031

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2016-07-12

修回日期：2016-08-25

＊ 國家自然科學基金委重點項目（81330084）：基于系統生物學的原發性肝癌和大腸癌“異病同證”和“異病同治”的研究，負責人：蘇式兵。上海市衛生和計劃委員會科研課題資助項目(20134173)：固腸方保護腸屏障功能減少大腸癌術后轉移的臨床研究，負責人：王文海；浦東新區衛生系統重點學科群建設項目(PWZxq2014-12)：肝癌和大腸癌的辯證施治研究，負責人：王文海。

＊＊ 通訊作者：蘇式兵，本刊編委，教授，博士生導師，主要研究方向：中醫藥系統生物學。