成分敲除技術在中藥藥效物質基礎研究中的應用＊

邵 曉，朱珂璇，張 薔，趙玉男

（南京中醫藥大學基礎醫學院實驗研究中心 南京 210046）

成分敲除技術在中藥藥效物質基礎研究中的應用＊

邵 曉，朱珂璇，張 薔，趙玉男＊＊

（南京中醫藥大學基礎醫學院實驗研究中心 南京 210046）

中藥藥效物質基礎研究是實現中藥現代化的關鍵問題之一。近年來，中藥藥效物質基礎的研究逐漸引入成分敲除技術，主要包括色譜敲除法和抗體敲除法。該類方法可以探討同一成分在不同中藥中的作用貢獻，以及不同成分在同一中藥中針對不同活性的作用貢獻，并對此進行主次區分與排序，從而獲得新的研究結果。成分敲除技術的運用，不僅有助于從全新的角度理解中藥藥效物質基礎和制定科學的質量控制標準，而且有助于理解中藥單味藥內部不同成分之間“配伍”的現代科學意義。

中藥 藥效物質基礎 成分敲除 色譜敲除法 抗體敲除法

隨著現代醫藥科學技術的飛速發展，中藥藥效物質基礎研究已成為當下的研究熱點[1]。中藥藥效物質基礎研究不僅闡明了中藥作用的原理，而且為控制中藥的質量打下了堅實的基礎。中藥從古至今一直被廣泛運用并且有著確切的療效，其中所含的復雜物質基礎便是發揮作用的關鍵[2]。眾所周知，中藥是一個復雜體系，即使是單味中藥，其本身也由多樣性成分構成， 影響其質量的因素更為復雜多樣。研究表明：中藥多種成分之間存在著協同拮抗等相互作用，即中藥中某個單體成分在干預動物或人體時必然受到其它成分藥理和藥效作用的影響[3]。中藥特定藥效作用的物質基礎是其所含的化學成分，因而全面評價中藥質量的關鍵是對產生藥效的特定化學成分的檢驗。目前，開展中藥化學成分與其功效間關聯度的研究思路主要是通過對不同途徑獲得的化學成分進行藥理活性或藥效評價，以該評價結果作為判斷其是否與中藥整體功效主治相關。但該研究思路僅用于推測某一單體成分與中藥功效間是否存在相關性，并不能為其在整體藥效作用中的貢獻度提供直接的證據。最近，在基因敲除研究模式的影響下，成分敲除技術（Ingredient Knock-Out Technology）被逐漸引入到中藥藥效物質基礎的研究中。成分敲除技術，包括色譜敲除法和抗體敲除法，指的是在研究某一特定成分的功能時，將目標成分從復合物中敲除，并通過對比分析成分敲除前后復合物藥效的變化來揭示該成分的作用，可以探討同一成分在不同中藥中的作用貢獻，以及不同成分在同一中藥中針對不同活性的作用貢獻，并對此進行主次區分與排序，從而獲得新的研究結果。成分敲除技術的運用，不僅有助于從全新的角度理解中藥藥效物質基礎和制定科學的質量控制標準，而且有助于理解中藥單味藥內部不同成分之間“配伍”的現代科學意義。

1 色譜敲除法

1.1 研究思路

制備液相色譜系統可應用于中藥研究中化學成分的分離和純化，其原理是通過混合物中各成分物理化學性質的差異，使其不同程度地分布于兩個不相溶的相中，并在兩相的相對運動過程中發生多次分布以達到分離的目的[4]。研究顯示，現代制備液相色譜系統的收集及分離技術成熟且具有較高的效率，可用于剔除中藥中某個單一成分或化學特征部位。

1.2 應用實例

紅花是活血化瘀的傳統中藥，其現代藥理研究表明：紅花可以降低細胞氧化損傷，具有較好的抗氧化活性，治療腦缺血、心肌缺血等心腦血管疾病與紅花的抗氧化活性密不可分[5-7]。王林艷等[8]把抗氧化效應評價與制備液相剔除技術相結合，并在該基礎上，尋找到一種新穎有效的中藥效應物質研究方法。該方法在一定程度上顯示了中藥的不同成分在發揮作用的過程中所體現出來的成效以及成效的多少。研究表明，紅花中分離出的有效成分6-羥基山柰酚-3，6-二氧葡萄糖-7-氧葡萄醛酸苷，羥基紅花黃色素A和脫水紅花黃色素B等是對紅花抗氧化活性有重要貢獻，可直接發揮紅花的抗氧化活性，還可通過結合其他成分間接地發揮紅花的抗氧化活性。

Gong A G等[9]通過液相色譜分離出當歸補血湯中的黃芪關鍵成分毛蕊異黃酮，化學結構類似β-雌二醇。相關研究發現，當歸補血湯具有促進雌激素、血紅素及骨細胞生成的作用，日常服用可以用來治療婦女更年期綜合征。比較原方和剔除毛蕊異黃酮后的功效，發現后者在細胞實驗中促進雌激素、血紅素及骨細胞生成的作用顯著降低。不過，在細胞實驗中單獨使用毛蕊異黃酮也未取得明顯上述作用。由此推測，毛蕊異黃酮在當歸補血湯中的作用主要是協調湯劑中多種藥理成分以達到最大的生物化學效應。

2 抗體敲除法

2.1 基本原理

中藥化學成分復雜，用抗體敲除法研究藥物成分與功效間關聯度的原理類似于“基因敲除”?！盎蚯贸笔侵冈谘芯磕骋惶囟ɑ虻墓δ軙r，將目標基因從全基因中敲除，并通過對比分析基因敲除前后生理效應的變化來揭示該基因的功能。研究證明，基因敲除技術已被廣泛應用于研究特定基因功能的有效途徑。同樣研究中藥中某一特定成分在整體藥味中的作用可以通過比較分析將其敲除前后中藥功效的變化，以揭示該中藥成分與整體藥物功效之間的相關性。

2.2 技術策略

采用生物技術手段制備中藥小分子單克隆抗體，結合免疫親和色譜特異性敲除/剔除提取物中某個有效成分進行中藥藥效物質基礎的研究技術。研究表明，該技術策略不僅將中藥復方中關鍵的有效成分及具有協同作用的天然成分的作用理清，并且在中藥藥效物質基礎研究中發揮不可或缺的作用[10]。

2.3 小分子單克隆抗體技術

2.3.1 小分子半抗原

小分子物質（即半抗原）指的是相對分子質量小于5 000的分子。由于小分子物質沒有免疫原性，不具有獨立激發人或動物體內產生抗體的作用，需與大分子物質偶聯生成人工抗原免疫人或動物，才能使人或動物產生免疫應答產生相應抗體[11]。目前國內外眾多學者較為全面的研究了基于單克隆抗體的小分子免疫分析方法，建立了多種小分子半抗原的合成方法，并初步應用于環境監測、食品農藥殘留及毒品快速測定中[12-14]。

2.3.2 免疫親和色譜

免疫親和色譜柱技術通過將抗體連接臂結合在固相介質上，使抗體與其有生物特異親和性的抗原分子相結合，從而達到分離純化的目的。研究表明，免疫親和色譜柱技術已在抗體純化等方面廣泛應用[15]。因此，小分子單克隆抗體技術即通過具有中藥活性成分的單克隆抗體制備相應的免疫親和色譜柱，從而特異性地敲除藥材或復方中該化合物的某一成分以達到純化的目的。

2.4 應用實例

陳亮等[16]利用抗體敲除技術將柚皮苷從經典方劑四逆散中剔除。主要過程如下：①合成柚皮苷的完全抗原：柚皮苷與牛血清白蛋白的結合物；②獲得抗血清即通過合成的完全抗原對新西蘭兔進行免疫；③制成免疫親和色譜柱：將獲得的抗血清純化后與經 CNBr 活化的Sepharose 4B 凝膠共價偶聯；④上樣：上樣于親和色譜柱，上樣液為四逆散樣品提取物；⑤洗脫：獲得特異性剔除柚皮苷的四逆散樣品。

人參的主要活性成分是人參皂苷，單克隆抗體技術可以用于制備其敲除提取物并研究其生物活性[17]。研究表明：人參皂苷Re及西洋參漿果提取物均可將小鼠禁食血糖的水平大幅度降低；而西洋參漿果提取物在剔除掉人參皂苷Re之后其降血糖效應大大減少，從而提示西洋參漿果提取物中擁有顯著降血糖效應的成分是人參皂苷Re[18]。除此之外，人參皂苷Re的提取物制備為檢驗人參皂苷Re在治療糖尿病和肥胖中的重要性亦提供了一種理想的方式[19]。

屈會化等[19]采用免疫親和色譜柱技術特異性敲除了葛根藥材提取物中的葛根素，并研究了人臍靜脈內皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC）分泌內皮素-1（Endothelin 1，ET-1）水平在葛根素敲除前后的影響，其研究結果表明：葛根總提取液與特異性敲除葛根素后的葛根提取液之間，葛根素純品與特異性敲除葛根素后的葛根提取液之間均存在顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01），而葛根總提取液與葛根素純品無明顯差異（P＞0.05），提示HUVEC分泌ET-1的水平與葛根素的生物效應密切相關，證明了葛根素與葛根功效之間具有明確的相關性。

Uto T等通過抗體敲除法研究了甘草在特異性敲除甘草皂苷前后對一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）蛋白水平的影響。研究結果顯示：甘草提取物可以抑制內毒素刺激巨噬細胞釋放NO和誘導型NO合酶的表達；剔除甘草皂苷后的抑制作用較甘草提取物有了顯著的減少；而單獨給予甘草皂苷卻無抑制作用。以上研究結果表明，甘草皂苷對甘草提取物中的其他成分發揮抑制巨噬細胞誘導型NO合酶的表達有一定的協同作用[20，21]。

表1 色譜敲除法和抗體敲除法的比較

3 小結

中藥廣泛應用于疾病的預防和治療，快速分離純化技術對于理解中藥復雜的物質基礎、控制中藥質量和發現潛在活性物質具有重要意義，也是目前中藥研究的熱點問題之一[22]。成分敲除技術具有明顯的中醫藥特色且高效精準，具體表現為該技術可將中醫藥理論的整體觀、系統觀運用于實際，并突顯中醫藥多成分協同拮抗的豐富內涵。中醫藥特色指該模式始終把中醫方藥作為一個整體或系統思考，且該模式可又好又快地辨別中藥譜效關系和量效關系的真實性，并在此基礎上實現中藥（化學）質量標準的研究。因此，中藥成分在治療及應用過程中的具體效應可通過敲除技術的廣泛運用進一步探查。中藥一般多以同母核結構形式存在（類似物），各成分之間的活性差異有時未必很大，即多表現出集成效應。研究中如果出現去掉某一成分后藥效影響很大，可說明該成分是發揮藥效的關鍵成分，應在質量標準制定時重點設定；如果出現藥效影響不大的現象，說明該成分的效應可被其它類似物所取代，且與其它結構類似物之間不產生協同作用，可不作為質控的指標成分（特征性成分除外）。

目前，成分敲除技術國內外已陸續應用于藥效物質基礎的研究，不過相關研究的數量偏少，未來有很大的發展空間。在研究中是采用色譜敲除法還是抗體敲除法，由于實踐的相對匱乏，因此提出客觀的評述是困難的。不過，基于這兩種敲除法的原理，可初步分析得到兩者的適用范圍和優缺點（表1）?？贵w敲除法采用的是免疫親和色譜，因此整個制備過程需要在水相中完成，僅適用于水溶性較強的小分子或大分子化合物的敲除，不如色譜敲除法適用范圍廣。不過，由于采用的是抗體和抗原之間的特異性結合原理，抗體敲除法天然選擇性高，抗體大規模制備成本相對低；而色譜敲除法的選擇性受制于敲除化合物與其它化合物之間的分離效果，并需要專門的制備液相色譜系統。未來需要更多的實踐來驗證這些適用范圍和優缺點；如果屬實，那么如何拓展適用范圍以及克服優缺點是需要進一步研究的方向。

1 肖平,李祥 ,陳建偉,等. 中藥藥效物質基礎研究思路與方法概述. 時珍國醫國藥, 2014 , 25 (8):1935-1938.

2 肖小河,肖培根,王永炎,等. 中藥科學研究的幾個關鍵問題. 中國中藥雜志，2009,34(2):119-123.

3 郭倩, 田成旺,任濤,等. 中藥藥效物質基礎研究進展. 世界科學技術—中醫藥現代化,2015,17(3):648-654.

4 陳鴛誼,李行諾,張翠萍,等. 高效制備液相色譜在天然產物分離中的應用. 藥學進展,2010,34(8):337-343.

5 謝明勇,王慧琴,聶少平. 紅花提取物抗氧化活性研究. 食品科學,2006,27(9):36-40.

6 葉錦霞,梁日欣,王嵐,等. 紅花水提物對ox-LDL損傷心肌微血管內皮細胞的保護作用及ESR譜研究. 中國中藥雜志,2008,33(21):2513-2517.

7 張曉隆,王方巖,徐正祄,等. 紅花對兔肺缺血/再灌注損傷及環氧酶表達的影響. 中國應用生理學雜志,2008,24(2):161-165.

8 王林艷,唐于平,劉欣,等. 基于選擇性剔除的紅花抗氧化效應物質基礎研究. 中國中藥雜志,2014,39(7):1285-1289.

9 Gong A G, Li N, Lau K M, et al. Calycosin orchestrates the functions of Danggui Buxue Tang, a Chinese herbal decoction composing of Astragali Radix and Angelica Sinensis Radix: An evaluation by using calycosin-knock out herbal extract. J Ethnopharmacol, 2015,168:150-157.

10 肖小河,鄢丹,袁海龍,等. 基于成分敲除/敲入的中藥藥效組分辨識與質量控制模式的商建. 中草藥, 2009, 40(9):1345-1348.

11 劉菁,毛新民,李琳琳,等. 小分子單克隆抗體的制備與敲除技術研究進展. 中國中藥雜志,2015,40(19):3737-3741.

12 Yau K Y, Lee H, Hall J C. Emerging trends in the synthesis and improvement of hapten-specific recombinant antibodies. Biotechnol Adv, 2003,21(7):599-637.

13 Eremin S A, Ryabova I A, Yakovleva J N, et al. Development of a rapid,specific fluorescence polarization immunoassay for the herbicide chlorsulfuron. Anal Chim Acta, 2002, 4682:229-236.

14 Ueda H. Sensitive noncompetitive measurement of small molecules by open sandwich immunoassay. Yakugaku Zasshi, 2007,127(1):71-80.

15 屈會化,趙琰,王慶國. 中藥小分子單克隆抗體技術平臺的構建.中草藥,2014,45(7):895-899.

16 陳亮,陳婷,徐強. 免疫親和色譜特異性剔除中藥方劑四逆散中的柚皮苷. 色譜,2006,24(3):243-246.

17 趙玉男. 中藥有效成分半抗原抗體應用研究進展. 中國中藥雜志,2013,38(5):657-660.

18 Yuan C S, Tanaka H. Bioactivity of American ginseng by knockout extract preparation using monoclonal antibody. Curr Drug Discov Technol, 2011,8(1):32-41.

19 趙琰,屈會化,王慶國. 利用單克隆抗體特異性敲除技術解析中藥藥效物質基礎的新方法. 中國中藥雜志, 2013, 38(17):2906-2910.

20 Uto T,Tuvshintogtokh I, Shoyama Y. Preparation of knockout extract for determination of really active compound using MAb. Curr Drug Discov Technol, 2011,8(1):16-23.

21 Uto T, Morinaga O, Tanaka H, et al. Analysis of the synergistic effect of glycyrrhizin and other constituents in licorice extract on lipopolysaccharide-induced nitric oxide production using knock-out extract. Biochem Biophys Res Commun, 2012,417(1):473-478.

22 謝秀滿,孫萬陽,黃競怡,等. 基于高壓制備液相的多維色譜技術在中藥分離純化中的應用. 分析化學,2016,44(7):1140-1147.

Application of Ingredient Knock-Out Technology in Pharmacodynamic Material Basis Research of Traditional Chinese Medicine

Shao Xiao, Zhu Kexuan, Zhang Qiang, Zhao Yunan
(Research Center, Basic Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China)

Studies on pharmacodynamic material basis are critical for the development of traditional Chinese medicine. Recently， ingredient knock-out technologies， including chromatography knock-out and antibody knock-out， were introduced to recent experimental studies. It was adopted for understanding the effects of the same ingredient in different herbal medicines and of different ingredients in the same herbal medicine. The ingredients were sorted distinctly and some new findings were obtained. So the utilization of ingredient knock-out technology not only brought a new perspective of comprehending pharmacodynamic material basis of traditional Chinese medicine and formulating appropriate criteria of quality control， but also was beneficial to understand the scientific significance of “compatibility” between different ingredients within a single herbal medicine in modern sense.

Traditional Chinese medicine， pharmacodynamic material basis， ingredient knock-out，chromatography knock-out， antibody knock-out

10.11842/wst.2016.09.021

R966

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2016-09-20

修回日期：2016-09-20

＊ 國家自然科學基金委青年基金項目（81303246）：腦局部糖原代謝在人參總皂苷抗應激致海馬結構可塑性損傷中的作用研究，負責人：趙玉男；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目（中西醫結合），負責人：黃熙。

＊＊ 通訊作者：趙玉男，副教授，主要研究方向：中藥藥理學。