雷公藤紅素抑制舌鱗癌細胞和人單核/巨噬細胞分泌血管內(nèi)皮生長因子實驗研究

賴河青馮紅超宋宇峰

雷公藤紅素抑制舌鱗癌細胞和人單核/巨噬細胞分泌血管內(nèi)皮生長因子實驗研究

賴河青1馮紅超2宋宇峰3

目的探討雷公藤紅素（Tri）對人單核/巨噬細胞（THP-1細胞）、舌鱗癌細胞（Tca8113細胞）分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血管內(nèi)皮生長因子-C（VEGF-C）的影響。方法在酸性微環(huán)境中，加入不同濃度的Tri，分別與Tca8113細胞、THP-1細胞+Tca8113細胞、THP-1細胞一起培養(yǎng)72h，ELISA法檢測細胞上清液中VEGF、VEGF-C含量，分析Tri對這兩種生長因子的影響。結(jié)果隨著Tri濃度以0、5、10、20、50μg/mL逐漸增高，各組的VEGF、VEGF-C值逐漸降低，且均與Tri濃度成負相關(guān)（P均＜0.001）。VEGF值：THP-1組分別為（57.41±2.13）、（53.12±1.23）、（46.43±2.11）、（44.24±1.14）、（38.15±0.93）μmol/L；Tca8113組分別為（61.45±2.73）、（58.14±1.63）、（55.33±2.15）、（50.22±1.66）、（41.11±1.45）μmol/L；THP-1+Tca8113組分別為（56.72±2.13）、（54.22±1.23）、（47.42± 2.14）、（43.52±1.16）、（39.12±0.83）μmol/L。VEGF-C值：THP-1組分別為（61.25±1.13）、（55.34± 2.11）、（51.23±1.30）、（48.22±2.13）、（45.21±1.62）μmol/L；Tca8113組分別為（61.33±2.16）、（57.43± 2.35）、（53.12±2.62）、（49.43±2.34）、（43.13±1.65）μmol/L；THP-1+Tca8113組分別為（60.35±2.13）、（55.74±2.15）、（50.13±1.61）、（47.42±2.14）、（40.11±1.55）μmol/L。THP-1+Tca8113細胞中各Tri劑量組VEGF、VEGF-C水平與THP-1細胞中各Tri劑量組的VEGF、VEGF-C水平相近，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但均低于Tca8113細胞中各Tri各劑量組VEGF、VEGF-C水平，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論隨Tri濃度的增加，Tri對THP-1和Tca8113細胞分泌VEGF、VEGF-C因子的抑制作用逐漸增強， THP-1細胞可提高Tri對VEGF、VEGF-C的抑制作用，有助于抑制舌癌的生長和轉(zhuǎn)移。

舌鱗狀細胞癌；雷公藤紅素；THP-1細胞；VEGF；VEGF-C

人單核/巨噬細胞（THP-1細胞）可以釋放多種細胞促瘤因子,包括血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）、血管內(nèi)皮生長因子-C（VEGF-C）等，VEGF、VEGF-C在促進腫瘤血管和淋巴管的生長方面起著重要作用[1]。在有氧環(huán)境下腫瘤細胞仍然進行糖酵解，即所謂的Warburg效應,導致生長旺盛的腫瘤細胞伴隨大量酸性代謝產(chǎn)物的排出，從而形成腫瘤細胞外的酸性微環(huán)境[2]。腫瘤酸性微環(huán)境是腫瘤細胞生長的特殊環(huán)境，特點是間質(zhì)壓力高、組織血供不足、營養(yǎng)相對缺乏、高酸低氧等特點[3]。在腫瘤治療過程中，利用THP-1細胞還可以提高其治療的效果。有研究[4]認為可能正是由于微環(huán)境的影響,使THP-1細胞出現(xiàn)了功能上的改變。因此，對于THP-1細胞在腫瘤酸性微環(huán)境中功能變化的探討，具有非常重要的臨床意義。我們將THP-1細胞與Tca8113細胞在不同濃度的Tri中共同培養(yǎng)，研究Tri對THP-1細胞功能的影響，報道如下。

1 實驗材料

1.1 人THP-1細胞 細胞系：THP-1細胞株（四川大學衛(wèi)生部移植工程和移植免疫重點實驗室）；人舌鱗癌細胞：Tca-8113細胞株（中國科學院細胞庫）。

1.2 主要試劑 Tri（99.9%）（Sigma公司）；人VEGF 及VEGF-C ELISA試劑盒（上海西唐公司）；雙抗（北京試劑廠）；RPMI-1640培養(yǎng)液（HyClone公司）；PBS液（武漢博士德公司）；二甲基亞砜（DMSO）（北京試劑廠）；0.25%含EDTA胰酶/胎牛血清（杭州四季青公司）。

1.3 主要儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific Forma公司）、EclipseE600倒置熒光顯微鏡（Nikon公司）、酶標儀（美國通用公司）、托盤天平（星潤達公司）、恒溫培養(yǎng)箱（美國通用公司）、超凈工作臺（美國通用公司）。

2 方法

2.1 配制Tri 實驗開始前，分別將Tri母液加入含

2%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液之中，然后將濃度調(diào)整為0、5、10、20、50μg/mL，最后用5.5%NaHCO3溶液及1mol鹽酸溶液，將pH調(diào)配至6.6，-20℃冰箱保存[4]。

2.2 復蘇凍存的THP-1細胞株 從-196℃液氮中取出凍存管后，迅速將其投入到盛有37℃溫水的杯中，使之快速解凍，用吸管將液體吸入到15mL的無菌離心管內(nèi)，置于離心機里，調(diào)速為1500r/min，離心5min，離心結(jié)束后，上清液用吸管吸棄，加進pH值為7.2含10%胎牛血清、青霉素100μg/mL、鏈霉素100μg/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基，直至5mL，在飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)傳代。

2.3 實驗分組 設THP-1細胞組、THP-1+Tca8113細胞組及Tca8113細胞組,各組細胞濃度分別為1× 106個/mL（THP-1+Tca8113細胞組中THP-1、Tca 8113各為0.5×106），各細胞組以Tri的濃度梯度為0、5、10、20、50μg/mL設5個Tri劑量組。以上各組每孔設3個復孔，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)72h，離心培養(yǎng)板，收集其上清液，ELISA法檢測VEGF和VEGF-C的含量。

2.4 ELISA法檢測 上清液中VEGF和VEGF-C的含量測定按照VEGF、VEGF-C的ELISA試劑盒說明書操作進行。

2.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，多組間LSD分表比較，Person線性相關(guān)分析。檢驗水準α為0.05。

3 結(jié) 果

THP-1、Tca8113、THP-1+Tca8113細胞中，隨著Tri濃度的逐漸增高，VEGF、VEGF-C值均逐漸降低，且均與Tri濃度成負相關(guān)（RVEGFTHP-1=-0.534，RVEGF-CTHP-1= -0.554，RVEGFTca8113=-0.501，RVEGF-CTca8113=-0.515，RVEGFTHP-1+Tca8113=-0.516，RVEGF-CTHP-1+Tca8113=-0.525，P均＜0.001）；THP-1+Tca8113細胞組各Tri劑量組VEGF、VEGFC水平與THP-1細胞組中各Tri劑量組VEGF、VEGF-C水平相近，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但均低于Tca8113細胞組各Tri劑量組VEGF、VEGF-C，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組細胞培養(yǎng)后VEGF、VEGF-C水平比較（μmol/L，±s）

表1 各組細胞培養(yǎng)后VEGF、VEGF-C水平比較（μmol/L，±s）

注：與Tca8113組比較，△P＜0.05；Tri：雷公藤紅素；VEGF：血管內(nèi)皮生長因子；VEGF-C：血管內(nèi)皮生長因子-C；Tca8113：舌鱗癌細胞；THP-1：人單核/巨噬細胞

組別 小組THP-1組3 Tri（μg/mL）0 5 1 0 20 50 Tca8113組3 0 5 1 0 20 50 THP-1+Tca8113組3 0 5 1 0 20 50 VEGF 57.41±2.13 53.12±1.23 46.43±2.11 44.24±1.14 38.15±0.93 61.45±2.73 58.14±1.63 55.33±2.15 50.22±1.66 41.11±1.45 56.72±2.13△54.22±1.23△47.42±2.14△43.52±1.16△39.12±0.83△VEGF-C 61.25±1.13 55.34±2.11 51.23±1.3 48.22±2.13 45.21±1.62 61.33±2.16 57.43±2.35 53.12±2.62 49.43±2.34 43.13±1.65 60.35±2.13△55.74±2.15△50.12±1.61△47.42±2.14△40.11±1.55△

4 討 論

在舌癌中，THP-1細胞能通過分泌促進腫瘤血管和淋巴管生成的VEGF因子和VEGF-C因子，從而促進腫瘤的生長[5]。Torisu等[6]發(fā)現(xiàn)，只要將人黑色素腫瘤細胞以及THP-1細胞共同培養(yǎng)，可明顯加強VEGF和VEGF-C的分泌能力。VEGF-C是目前研究中促進腫瘤淋巴管生成并與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切的因子之一[7]，在酸性微環(huán)境中，VEGF因子使血管內(nèi)皮細胞增殖、細胞外基質(zhì)合成，促進腫瘤內(nèi)的血管形成[8]。微環(huán)境中白細胞介素-1等細胞因子也均能誘導促使THP-1細胞產(chǎn)生VEGF，從而促進血管生成[9]。

Mantovani等[10]認為活化的巨噬細胞中包含有兩種表型：M1巨噬細胞，它能表達主要組織相容性復合體Ⅱ等高呈遞抗原，參與了T細胞I型免疫應答，可殺傷腫瘤細胞；M2巨噬細胞，它能夠限制炎性反應和Th1型免疫應答，促進腫瘤的發(fā)展。Cassetta等[11]研究認為腫瘤微環(huán)境局部缺氧、高乳酸等影響了單核巨噬細胞的分化過程，可能發(fā)生了替代性活化，參與腫瘤的生長、進展和轉(zhuǎn)移等過程。但也有研究認為，單核巨噬細胞可分泌免疫調(diào)節(jié)因子和酶從而發(fā)揮抗腫瘤免疫作用，并將腫瘤抗原呈遞給細胞毒T淋巴細胞可認為仍兼具部分M1表型的功能[12]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，Tri對Tca8113和THP-1細胞分泌VEGF和VEGF-C因子具有明顯的抑制作用，隨著Tri濃度的增加和時間的延長，Tri對 THP-1和Tca8113細胞分泌VEGF、VEGF-C因子的抑制作用逐漸增強，組間比較發(fā)現(xiàn)，在THP-1的參與下，Tri對VEGF、VEGF-C的抑制作用更加明顯，可能有助于抑制舌癌的生長和轉(zhuǎn)移，為抗腫瘤治療提供一條新的途徑。

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（收稿：2016-03-23 修回：2016-05-11）

Effect of Tripterine on Vascular Endothelial Growth Factor Secretion of Squamous Cell Carcinoma and Monocyte/macrophages

LAI Heqing1,FENG Hongchao2,SONG Yufeng3.1 VIP Department,Hangzhou Stomato-logical Hospital,Hangzhou (310006),China; 2 Guiyang Stomatological Hospital,Guiyang (550004),China;3 Guizhou Food and Drug Administration,Guiyang(550004),China

ObjectiveTo investigate the effect of tripterine on vascular endothelial growth facor（VEGF）and VEGF-C secretion of monocyte/macrophages（THP-1 cells）.MethodsOral squamous cell carcinoma cells （Tca8113 cells）and THP-1 cells were cultured with different concentrations of tripterine separately or together for 72 h in vitro,then VEGF and VEGF-C contents in supernatants were detected with ELISA method.ResultsAs the concentration of tripterine increased from 0,5,10,20 to 50 μg/mL,the contents of VEGF and VEGF-C decreased gradually in all groups,which indicated a negative relation to the dose of tripterine（all P＜0.001）.The results of VEGF contents in THP-1,Tca8113,and THP-1+Tca8113 groups were as follows：THP-1：57.41±2.13, 53.1±1.23,46.43±2.11,44.24±1.14,38.15±0.93 μmol/L;Tca8113：61.45±2.73,58.14±1.63,55.33±2.15,50.22±1.66, 41.11±1.45 μmol/L;THP-1+Tca8113：56.72±2.13,54.22±1.23,47.42±2.14,43.52±1.16,39.12±0.83 μmol/L.The results of VEGF-C contents in THP-1,Tca8113,THP-1+Tca8113 groups were as follows：THP-1：61.25±1.13,55.34±2.11,51.23±1.30,48.22±2.13,45.21±1.62 μmol/L;Tca8113：61.33±2.16,57.43±2.35,53.12±2.62,49.43± 2.34,43.13±1.65 μmol/L;THP-1+Tca8113：60.35±2.13,55.74±2.15,50.13±1.61,47.42±2.14,40.11±1.55 μmol/L）. The contents of VEGF and VEGF-C in THP-1+Tca8113 groups were not significant different from those in THP-1 groups at each tripterine concentration（P＞0.05）,but significantly lower than those in Tca8113 groups（P＜0.05）.ConclusionTripterine can more inhibit VEGF and VEGF-C secretion of THP-1 cells and Tca8113 cells as its concentration increases.THP-1 may enhance the inhibition of tripterine on VEGF and VEGF-C,which may result in suppressing the growth and metastasis of oral squamous cell carcinoma.

oral squamous cell carcinoma;tripterine;THP-1;VEGF;VEGF-C

貴州省科技計劃項目[黔教育發(fā)（2010）305號]

1杭州口腔醫(yī)院總院特需科（杭州 310006）；2貴州省貴陽市口腔醫(yī)院副院長室（貴陽 550004）；3貴州省食品藥品監(jiān)督管理局局長室（貴陽550004）

馮紅超，Tel：13984030259；E-mail：hongchaof@126.com