牛蒡子苷對(duì)L6骨骼肌細(xì)胞中腺苷酸活化蛋白激酶信號(hào)通路的影響

相　芳,魏　瑋，相　紅，王玉蘭，季　蔚，許　諾，萬(wàn)小梅

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·論著·

牛蒡子苷對(duì)L6骨骼肌細(xì)胞中腺苷酸活化蛋白激酶信號(hào)通路的影響

相芳1,魏瑋1，相紅2，王玉蘭3，季蔚1，許諾1，萬(wàn)小梅1

1. 210002江蘇南京，解放軍81醫(yī)院藥劑科；2. 210000江蘇南京，南京軍區(qū)第一干休所；3. 210005江蘇南京，南京軍區(qū)第二干休所

[摘要]目的探討牛蒡子苷在L6骨骼肌細(xì)胞中對(duì)葡萄糖消耗和腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。方法用含 2%胎牛血清的1640培養(yǎng)基誘導(dǎo)L6骨骼肌細(xì)胞分化，直至細(xì)胞生長(zhǎng)出肌管，分化完成后的L6骨骼肌細(xì)胞用含有不同濃度牛蒡子苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)細(xì)胞葡萄糖消耗，western blot法檢測(cè)AMPK的亞單位AMPKα和磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMP-activated protein kinase，p-AMPKα)的蛋白表達(dá)水平；以real-time PCR法檢測(cè)過(guò)氧化物酶體增生物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome-proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)mRNA表達(dá)水平。結(jié)果牛蒡子苷濃度為1000 g/L時(shí)，可增加L6骨骼肌細(xì)胞的葡萄糖消耗，差異顯著(P<0.01)；與對(duì)照組相比，牛蒡子苷呈濃度依賴性的增強(qiáng)L6骨骼肌細(xì)胞中p-AMPKα蛋白表達(dá)水平；并以相同的趨勢(shì)增強(qiáng)PGC-1α mRNA表達(dá)水平。結(jié)論牛蒡子苷增加L6骨骼肌細(xì)胞的葡萄糖消耗，并激活A(yù)MPK/PGC-1α信號(hào)通路，具有潛在的改善胰島素抵抗的作用。

[關(guān)鍵詞]牛蒡子苷；胰島素抵抗；腺苷酸活化蛋白激酶；L6骨骼肌細(xì)胞

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球有3.47億人患有糖尿病，預(yù)計(jì)至2030年糖尿病將成為全球第七大死亡原因，糖尿病患者中約90% 為2型糖尿病(T2DM)[1]。2型糖尿病是以胰島素分泌相對(duì)不足和胰島素抵抗(insulin resistance，IR)為特征的代謝綜合征，改善胰島素抵抗是降低血糖和防治糖尿病并發(fā)癥的重要干預(yù)措施[2]。肌肉組織是維持葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)的主要組織，研究表明骨骼肌中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)減少可以導(dǎo)致機(jī)體葡萄糖攝取能力受損，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)生[3]。因此，促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)是改善胰島素抵抗的重要治療措施。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)作為細(xì)胞的“能量感受器”在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著重要作用。研究表明，激活A(yù)MPK可促進(jìn)骨骼肌中不依賴胰島素的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，增加胰島素敏感性，因此，AMPK途徑是改善胰島素抵抗及治療2型糖尿病的重要靶點(diǎn)[4]。

牛蒡子苷(Arctiin，ARC)是從菊科兩年生草本植物牛蒡?qū)倥］?ArctiumlappaL.)的干燥成熟果實(shí)牛蒡子中提取分離的木脂素類化合物[5]，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。大量研究表明牛蒡子苷及其苷元對(duì)改善炎癥、抗腫瘤和改善腎病等具有顯著療效[6-8]。本研究通過(guò)觀察牛蒡提取物牛蒡子苷對(duì)L6骨骼肌細(xì)胞中AMPK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而研究牛蒡子苷對(duì)胰島素抵抗的改善作用。由于哺乳動(dòng)物的AMPK是一個(gè)三聚體結(jié)構(gòu)，由α、β、γ三個(gè)亞單位組成，通常研究中所檢測(cè)的總AMPK及活性AMPK蛋白是指其α亞單位。本研究即檢測(cè)AMPK的亞單位AMPKα和磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMP-activated protein kinase，p-AMPKα)的蛋白表達(dá)水平，并檢測(cè)過(guò)氧化物酶體增生物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome-proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)mRNA的表達(dá)。以探討牛蒡子苷在L6骨骼肌細(xì)胞中對(duì)葡萄糖消耗和AMPK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。

1材料與方法

1.1主要試劑牛蒡子苷為四川省維克奇生物科技有限公司產(chǎn)品(批號(hào)：150821，純度：>98%)。1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清和青霉素鏈霉素混合液購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；葡萄糖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自普利萊基因技術(shù)有限公司； Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR引物購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；SYBR Supermix試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；熒光定量 PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；AMPK和p-AMPK蛋白含量檢測(cè)相關(guān)試劑：AMPK α亞型、p-AMPK α亞型(蘇氨酸172位點(diǎn))和β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2小鼠L6細(xì)胞小鼠L6骨骼肌細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection, ATCC)。

1.3L6細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化L6骨骼肌細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加青霉素100 U/mL及 鏈霉素100 U/mL。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，換為含 2%胎牛血清的1640培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化，每隔2 d換液，直至細(xì)胞生長(zhǎng)出肌管，培養(yǎng)6 d。分化完成后的L6骨骼肌細(xì)胞在含有不同濃度牛蒡子苷的無(wú)血清1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，然后進(jìn)行葡萄糖消耗檢測(cè)及蛋白和RNA提取。

1.4葡萄糖消耗分析將96孔板中分化完成的L6骨骼肌細(xì)胞分別用濃度為1000、100、10、及0 g/L(對(duì)照組)的牛蒡子苷溶液適量處理24 h后，采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)各孔培養(yǎng)基中葡萄糖量，用不含細(xì)胞的孔內(nèi)培養(yǎng)基中葡萄糖量均值減去各組培養(yǎng)孔的培養(yǎng)基中剩余葡萄糖量，即為每孔細(xì)胞葡萄糖消耗量。

1.5Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)水平收集加藥處理24 h后的細(xì)胞，按照說(shuō)明書(shū)操作，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取30 μg細(xì)胞蛋白提取液，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜。用含0.1%吐溫20的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖鹽溶液(TBST)洗膜3×5 min。再加HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，Tris-HCl緩沖溶液洗滌后按照說(shuō)明書(shū)操作顯色。以β-actin作為內(nèi)參，采用Quantity One軟件對(duì)Western Blot條帶進(jìn)行分析。

1.6實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)PGC-1α mRNA表達(dá)水平按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取細(xì)胞總RNA，每個(gè)樣品取1 g RNA按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Bio-Rad熒光定量PCR儀檢測(cè)各目的基因mRNA表達(dá)水平。GAPDH上游引物5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下游引物5′-GGCCATCCACAGTCTTCTGG-3′；PGC-1α上游引物5′-GCCCGGTACAGTGAGTGTTC-3′，下游引物5′-CTGGGCCGTTTAGTCTTCCT-3′[由寶生物工程(大連)有限公司提供]；擴(kuò)增條件為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s；72 ℃ 15 s；65～95 ℃，每升高0.5攝氏度保持10 s；共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完畢后，根據(jù)循環(huán)數(shù)(Ct 值)對(duì)所有基因的表達(dá)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果

2.1牛蒡子苷增加L6骨骼肌細(xì)胞中葡萄糖消耗葡萄糖消耗是檢測(cè)細(xì)胞葡萄糖攝取能力的常用指標(biāo)。如圖2所示，牛蒡子苷可以促進(jìn)L6骨骼肌細(xì)胞的葡萄糖消耗，當(dāng)牛蒡子苷濃度為1000 g/L時(shí)，葡萄糖消耗量為對(duì)照組的1.8倍。

2.2牛蒡子苷增強(qiáng)L6骨骼肌細(xì)胞AMPK蛋白磷酸化水平如圖3所示，牛蒡子苷對(duì)AMPKα蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯影響，但牛蒡子苷呈濃度依賴型增強(qiáng)p-AMPKα蛋白表達(dá)。

2.3牛蒡子苷增強(qiáng)L6骨骼肌細(xì)胞PGC-1α mRNA表達(dá)水平PGC-1α是AMPK的下游效應(yīng)分子，參與調(diào)控線粒體功能和生物發(fā)生，并影響胰島素抵抗[9]。如圖4所示，分別用不同濃度的牛蒡子苷處理分化完成的L6細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，牛蒡子苷各處理組的PGC-1α mRNA表達(dá)水平顯著升高，并且這種作用隨著牛蒡子苷給藥濃度增加而增強(qiáng)。

3討論

AMPK在維持內(nèi)環(huán)境能量穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，被稱為“細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器”。在探求新型作用分子來(lái)治愈2型糖尿病的過(guò)程中，AMPK作為一個(gè)創(chuàng)新性的藥理靶點(diǎn)，已得到廣泛關(guān)注。2型糖尿病是一種較多發(fā)生的代謝性疾病，胰島素抵抗是其主要病理特征之一[10]。產(chǎn)生胰島素抵抗時(shí)，組織對(duì)胰島素刺激的葡萄糖攝取和利用效率降低[11]。骨骼肌的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)是機(jī)體攝取葡萄糖的主要方式，對(duì)于維持機(jī)體葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要作用[12]。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)主要有兩條途徑：一條是胰島素依賴途徑，另一條是非胰島素依賴的信號(hào)途徑，即AMPK途徑。對(duì)于2型糖尿病患者，骨骼肌中胰島素介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)已經(jīng)受損，因此，改善AMPK途徑的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)成為2型糖尿病更有效、更具前景的治療靶點(diǎn)[13]。AMPK激活可以刺激骨骼肌中葡萄糖攝取和脂肪酸氧化，增強(qiáng)能量代謝，且這種作用不依賴于胰島素[14]。在發(fā)生胰島素抵抗的2型糖尿病動(dòng)物模型中，其肝臟、肌肉和脂肪組織中AMPK的活性比正常組明顯降低，而AMPK激動(dòng)劑可以有效降低血糖及改善胰島素抵抗[15]。本研究表明，用牛蒡子苷處理L6骨骼肌細(xì)胞可以顯著增加細(xì)胞的葡萄糖消耗，升高AMPK蛋白的磷酸化水平，增強(qiáng)AMPK活性，表明牛蒡子苷可以促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞的葡萄糖攝取，對(duì)胰島素抵抗具有潛在改善作用。

PGC-1α是一種核轉(zhuǎn)錄共激活因子，在調(diào)節(jié)能量平衡中起著重要作用，AMPK激活可以增加PGC-1α的表達(dá)水平[16]。近年來(lái)，PGC-1α在線粒體功能和胰島素抵抗中的作用成為研究熱點(diǎn)[17]。有研究表明增強(qiáng)PGC-1α活性可以改善線粒體代謝及促進(jìn)線粒體發(fā)生[18]。另有研究表明PGC-1α可以增強(qiáng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(glucose transporter type 4，GLUT4)mRNA表達(dá)水平，提高肌細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力及對(duì)胰島素的敏感性，進(jìn)而降低血糖[19]。本研究亦顯示，牛蒡子苷可以濃度依賴性地增強(qiáng)L6骨骼肌細(xì)胞中PGC-1α的基因表達(dá)水平，證實(shí)牛蒡子苷具有潛在的增強(qiáng)胰島素敏感性的作用。

綜上所述， AMPK信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)葡萄糖攝取且不依賴于胰島素，是改善胰島素抵抗的有效途徑；牛蒡子苷可以增加L6骨骼肌細(xì)胞的葡萄糖消耗，增強(qiáng)AMPK活性，并促進(jìn)PGC-1α轉(zhuǎn)錄，表明牛蒡子苷具有潛在地增強(qiáng)胰島素敏感性和改善2型糖尿病臨床癥狀的作用。

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(本文編輯：張仲書(shū)；英文編輯：王建東)

Effect ofarctiin on AMPK signal pathway in L6 myotubes

XIANG Fang1, WEI Wei1, XIANG Hong2,WANGYu-lan3,JIWei1,XUNuo1,WANXiao-mei1.

1.DepartmentofPharmacy, 81HospitalofPLA,Nanjing,Jiangsu210002,China; 2.TheFirstSanatoriumforRetiredCadres,NanjingMilitaryCommand,PLA,Nanjing,Jiangsu210000,China; 3.TheSecondSanatoriumforRetiredCadres,NanjingMilitaryCommand,PLA,Nanjing,Jiangsu210005,China

[Key words]arctiin; insulin resistance; AMPK; L6 myotubes

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of arctiin on glucose consumption and AMPK pathway in L6 myotubes. MethodsL6 myoblasts were differentiated to myotubes and treated with or without arctiin. After 24 h, glucose oxidase method was performed at the end of treatment and the AMPKα and p-AMPKα levels were detected by western blot (mammalian AMPK is a trimer structure that composed of alpha, beta, gamma of three subunits, and the content detection of total AMPK and activated AMPK proteins usually refers to the alpha subunit.); The PGC-1α mRNA level were measured with real-time PCR. ResultsThe result of glucose oxidase assay suggested that arctiin increase. Compared with control group, arctiin enhanced the activity of p-AMPKα with a concentration-dependent manner, and arctiin promoted the transcription of PGC-1α with a concentration-dependent manner, too. ConclusionArctiin increases glucose consumption and activates AMPK/PGC-1α signal pathway in L6 myotubes, which suggests that arctiin could potentially improve insulin resistance.

通訊作者：魏瑋，E-mail：gynkey@sina.com

[中圖分類號(hào)]R966

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi：10.3969/j.issn.1672-271X.2016.02.015

(收稿日期：2015-12-08；修回日期：2016-01-25)

引用格式：相芳,魏瑋，相紅,等.牛蒡子苷對(duì)L6骨骼肌細(xì)胞中腺苷酸活化蛋白激酶信號(hào)通路的影響[J].東南國(guó)防醫(yī)藥，2016,18(2):157-159,187.