miRNA21在潰瘍性結腸炎患者中表達的意義*

北京大學深圳醫(yī)院消化內科 （廣東 深圳 518035）

何興楨 李 曦

miRNA21在潰瘍性結腸炎患者中表達的意義*

北京大學深圳醫(yī)院消化內科 （廣東 深圳 518035）

何興楨 李 曦

目的研究潰瘍性結腸炎患者血清miRNA21的水平，并探討其在潰瘍性結腸炎發(fā)展中的意義。方法選取潰瘍性結腸炎患者25例及正常對照組20例，采用qRT-PCR方法檢測血清miRNA21的水平。結果潰瘍性結腸患者血清miRNA21的水平為1.32±0.24，正常對照組血清miRNA21的水平為1.11±0.17。潰瘍性結腸組有輕度升高，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結論潰瘍性結腸炎患者血清miRNA21的表達上調，可能為潰瘍性結腸炎的治療及臨床診斷提供新的方向。

微小RNA21；潰瘍性結腸炎

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)屬于炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)中的一種，病變主要累及結直腸粘膜和粘膜下層，呈連續(xù)性彌漫性分布的慢性非特異性炎癥。近年來，我國潰瘍性結腸炎的發(fā)病率呈顯著上升趨勢[1]。2006年一項有關于潰瘍性結腸炎住院病例的回顧性分析顯示在中國潰瘍性結腸炎的患病率大約是11.6/10萬[2]。目前潰瘍性結腸炎的病因和發(fā)病機制仍不明確，考慮可能與環(huán)境、遺傳、感染和免疫等多因素相互作用有關[3-5]。有研究認為潰瘍性結腸炎與微小RNA(MiRNA)參與基因轉錄后水平的調控有關[6]。MicroRNA-21 (miR-21)作為在腫瘤及大多數炎癥性疾病中均顯著過表達的一種小分子核糖核酸[7-9]，本研究通過檢測其在潰瘍性結腸炎患者血清中的水平，與對照組對比，探討MicroRNA-21表達在潰瘍性結腸炎發(fā)病及發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 一般資料收集2013年3月至2014年11月期間我院住院和門診就診病人。潰瘍性結腸炎患者入組標準：根據中華醫(yī)學會消化病學分會炎癥性腸病學組炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012廣州)制定的標準進行診斷，所有入組患者均能確診為潰瘍性結腸炎(包括臨床類型、病情程度、病變范圍、病情分期、腸外表現(xiàn))。選取診斷潰瘍性結腸炎(活動期，輕型或中型，E1或E2期)的患者。健康人入組標準：沒有嚴重器質性病變，近期無感染病史的健康人群。

最后共收集符合條件的潰瘍性結腸炎組共25例，男性16例，女性9例，平均年齡(39.0±11.9)歲；正常對照組共20例，男性14例，女性6例，平均年齡(37.7±9.8)歲。

1.2 方 法

1.2.1 標本的采集和處理：取得患者的血液標本之后，將其放置直到血液凝固后析出血清，然后吸取上層液體和抗凝血液樣本，5000r/min，離心半徑10cm，離心15min，提取上清液

1.2.2 用常規(guī)qRT-PCR方法檢測方法：主要包括以下步驟：①總RNA提取，根據RNA提取試劑盒完成；②總RNA純度和完整性檢測；③逆轉錄；④定量PCR。大致具體過程如下：在采血后的24h內，分別吸取200 μL血漿，使用miRcute miRNA提取試劑盒的操作方法，進行miRNA的提取。完成后，吸取11μL的miRNA提取液，37℃反應1h加多聚腺苷酸，然后吸取2μL反應液37℃反應1h進行cDNA的合成。上述完成后，采用實時定量PCR的方法，檢測miR-21a的表達情況；采用20μL的反應體系，每孔加入5μL的cDNA，0.5 μL上游引物和下游引物，10μL 2X stbr greenpcr master mix，6.5μL的雙蒸水。反應條件如下：94℃反應65s，94℃反應15s，60℃反應30s退火，72℃反應32s延伸，反應進行42個循環(huán)。其中定量PCR用酶(SYBR Green PCR Master Mix)購自TOYOBO公司。

1.3 統(tǒng)計學方法計量資料按均數±標準差表示，使用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，對兩組患者血清miRNA21的水平進行t檢驗，P＜0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

潰瘍性結腸患者血清miRNA21的水平為1.32±0.24，正常對照組血清miRNA21的水平為1.11±0.17，潰瘍性結腸組miRNA21的水平較正常對照組有輕度升高(t＝-3.036, P＝0.035)。

3 討 論

潰瘍性結腸炎在西方國家的發(fā)病率較高，亞洲包括中國在內的地區(qū)較西方國家低，但是近年來發(fā)病率呈快速增長趨勢[1]。由于本病呈慢性過程，病程較長，且大部分患者反復發(fā)作，對患者的生活質量造成嚴重影響，對家庭和社會造成沉重負擔。潰瘍性結腸炎的發(fā)病機制目前還不明確，近年來的研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)生可能與炎癥損傷、免疫異常、遺傳等因素密切相關。針對遺傳因素，潰瘍性結腸炎與微小RNA關系已成為研究其發(fā)病機制的熱點。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內源性非蛋白編碼的小分子RNA，長度約為18-25個核苷酸，經過轉錄后水平性調節(jié)目的基因表達，從而在細胞增值、分化、生長發(fā)育以及凋亡等代謝過程中發(fā)揮重要作用[10]。McKenna LB等[11]研究發(fā)現(xiàn)Dicer1作為miRNA生成發(fā)展進程中的關鍵酶，將該基因敲除后，模型小鼠的腸上皮細胞分化受損，防御功能受損，腸上皮細胞有大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，表明微小RNA在潰瘍性結腸炎的發(fā)生發(fā)展中起了重要的調節(jié)作用[11]。已發(fā)現(xiàn)許多的miRNA參與調節(jié)炎癥性反應[12-14]，其中包括miR-21[12]，Gong等[14]揭示了miR-21有助于維持T細胞在正常效應范圍，從而有助于在炎癥性反應中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。Wu[15]等使用miRNA基因芯片技術以及PCR技術分析炎癥性腸病患者和正常對照組患者腸粘膜組織的miRNA表達情況，發(fā)現(xiàn)miR-21在活動期潰瘍性結腸炎患者中表達上調明顯。Takagi等[16]取12名活動期潰瘍性結腸炎患者和12名健康對照者的結腸活檢標本，檢測miRNA的表達差異，結果發(fā)現(xiàn)miR-15和miR-21的表達有上調。全基因組的關聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)8個miRNA在潰瘍性結腸炎患者中明顯上調，其中包括參與腸道上皮屏障功能的miRNA-21[17]。本實驗采用qRTPCR方法檢測潰瘍性結腸炎患者和健康對照組外周血的血清miRNA21，結果顯示潰瘍性結腸組miRNA21的水平較正常對照組有輕度升高(P＜0.05)。這和國內外的眾多研究結果相符[15-17]。目前對于潰瘍性結腸炎患者，主張采用內科綜合治療的手段[18]。探討miR-21的表達與潰瘍性結腸炎發(fā)生的關系，有助于進一步明確潰瘍性結腸炎的發(fā)病機制，從而為潰瘍性結腸炎的治療及臨床診斷提供新的方向。

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Analyze the Expression of miRNA21 in the Patients with Ulcerative Colitis*

HE Xing-zhen, LI Xi. Department of Gastroenterology Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China

ObjectiveAnalysis of miRNA21 in the patients with ulcerative colitis to investigate the pathogenesis of ulcerative colitis.Methods25 patients with ulcerative colitis and 20 healthy controls were detected. And the expression of miRNA21 was evaluated by using quantitative real-time polymerase chain reaction (QRT-PCR) analysis.ResultsmiRNA21 in serum of patients with ulcerative colitis was 1.32±0.24, higher than that 1.11±0.17 of the healthy control group, the difference had statistical signifcance (P＜0.05).ConclusionThe up-regulated expression of miRNA21 in the patients with ulcerative colitis might provide a new direction of therapy and clinical diagnosis for ulcerative colitis.

MiRNA21; Ulcerative Colitis

R574.1

A

深圳市科技計劃項目，編號201302056

10.3969/j.issn.1009-3257.2016.01.011

2016-01-18

何興楨，女，消化內科專業(yè)，主要研究方向：微小RNA在炎癥性腸病患者中差異性表達的機制及臨床意義。

李 曦