鹽酸埃克替尼對人T淋巴細胞增殖的影響

韓貴良 石巖 任冠穎 王小磊

（河北大學附屬醫院腫瘤內科，河北保定071000）

鹽酸埃克替尼對人T淋巴細胞增殖的影響

韓貴良 石巖 任冠穎 王小磊

（河北大學附屬醫院腫瘤內科，河北保定071000）

目的觀察酪氨酸激酶抑制劑（Tyrosine kinase inhibitor，TKI）鹽酸埃克替尼對人T淋巴細胞增殖的影響。方法應用免疫磁珠分選的方法從外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中分選出T淋巴細胞，分別加入不同濃度的鹽酸埃克替尼培養1 h后，加入PMA刺激T細胞增殖，培養48～72 h后分別收集細胞和細胞培養上清。采用四氮甲唑蘭比色法（MTT法）檢測各組細胞的增殖情況。結果本研究比較了培養72 h后各組細胞的增殖情況，發現鹽酸埃克替尼能夠抑制T細胞的增殖，各組抑制率如下：鹽酸埃克替尼1000 ng/mL組為（12.0±5.0）%（P=0.053），2500 ng/mL組為20.0±3.6%（P=0.011），5000 ng/mL組為21.6±5.6%（P=0.022）。結論鹽酸埃克替尼能夠抑制T細胞的增殖。

酪氨酸激酶抑制劑；腫瘤免疫；T淋巴細胞

鹽酸埃克替尼是我國具有完全自主知識產權的小分子靶向抗癌創新藥，臨床研究表明鹽酸埃克替尼在晚期非小細胞肺癌治療過程中顯示一定優越性[1]。有研究報道酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼[2]、達沙替尼[3]、厄洛替尼[4]能夠抑制T細胞的增殖，但鹽酸埃克替尼對T淋巴細胞的增殖有何影響，尚未見報道，故作者進行了相關研究，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料：①細胞：人外周血T淋巴細胞為從人外周富集血中分離；②細胞培養試劑：細胞培養液RPMI1640（美國Invitrogen公司），胎牛血清（美國Gibco公司），96孔培養板（美國Corning公司），Ficoll分離液（中國醫學科學院血液學研究所），Pan T cell isolation kitⅡ（德國Miltenyi Biotec公司）。

1.2 設備：超凈工作臺（上海力申科學儀器有限公司），HEPA CLASS100加濕CO2孵箱（美國Thermo公司），JX70倒置顯微鏡及照相系統（日本Olympus公司），Synergy HT酶標儀（美國BioTek公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 T細胞的分離：取4 mL富集外周血，Ficoll分離法提取單個核細胞，應用Pan T cell isolation kitⅡ分選單個核細胞，分選柱下方所收集細胞即為T細胞。

1.3.2 T淋巴細胞的培養：所得T細胞以細胞培養液重懸，使細胞濃度為1.5×106/mL，以200 μL每孔接種到96孔板中。設對照組、鹽酸埃克替尼組，對照組鹽酸埃克替尼濃度為0 ng/mL，鹽酸埃克替尼組設三個濃度：1000 ng/mL、2500 ng/mL、5000 ng/ mL；各組加入藥物后于37℃加濕5%CO2孵箱中培養1 h，然后各組均加入佛波酯（PMA），終濃度分別為50 ng/mL，培養48～72h。

1.3.3 MTT法檢測T細胞增殖情況：T淋巴細胞密度為1.5×106/mL，接種于96孔板中，每孔培養液200 μL，空白對照孔只加培養液。各組按1.3.2描述中加入藥物，37℃，5%CO2飽和濕度細胞培養箱孵育72 h，每組每濃度設3個復孔。每孔加入5 mg/ mL MTT液20 μL，繼續孵育4 h，離心培養板，吸棄上清，每孔加入DMSO150 μL，微量震蕩器震蕩10 min，490 nm波長下檢測每孔的吸光度（OD）值。按下列公式計算抑制率：抑制率=（1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

1.4 統計學方法：采用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，兩組定量資料的比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

鹽酸埃克替尼能夠抑制T淋巴細胞的增殖。我們比較了實驗組與對照組間的抑制率，鹽酸埃克替尼組1000ng/m組為12.0±5.0%（P=0.053），2500ng/ mLl組為20.0±3.6%（P=0.011），5000ng/mL組為21.6±5.6%（P=0.022）。隨藥物濃度增加，抑制率有提高趨勢，提示鹽酸埃克替尼對T細胞增殖的抑制呈濃度依賴性。

3 討論

鹽酸埃克替尼是我國自主研制的、具有世界專利的治療非小細胞肺癌的國家一類新藥，在分子水平，鹽酸埃克替尼抑制EGFR激酶活性的IC50（當50%酶活性被抑制時的抑制劑濃度）為5 nM，和國外上市產品相當。在測定了鹽酸埃克替尼對85種激酶（包括其突變型）的抑制活性的結果顯示，鹽酸埃克替尼在0.5 μM（100倍于對EGFR激酶活性抑制的IC50）時對EGFR激酶的抑制特異性較高，沒有顯示出對其它激酶的抑制，表明鹽酸埃克替尼是一個特異性較高的EGFR激酶抑制劑[5]。目前該藥物已廣泛應用于臨床，并改善了腫瘤患者的生存，但該藥物需長期應用，在用藥過程中是否會影響T細胞的增殖，目前尚未見報道，我們對此進行了研究。為了更加貼近臨床實際，我們選取人外周血中的T細胞作為研究對象，觀察了鹽酸埃克替尼對人T淋巴細胞增殖的影響。在實驗設計過程中，我們盡量使實驗條件與體內環境相似，藥物濃度的選取以腫瘤患者服藥后達到的穩態血藥濃度為參考，實驗藥物濃度均在其附近。按臨床常規劑量（125 mg tid）應用鹽酸埃克替尼，穩態血藥濃度為2500±378 ng/mL[6]，實驗組藥物濃度設為1000 ng/mL、2500 ng/mL、5000 ng/mL。MTT實驗發現，鹽酸埃克替尼能夠抑制T細胞的增殖，僅在較高濃度時具有統計學差異。鹽酸埃克替尼是通過何種機制抑制T淋巴細胞的增殖，目前已有酪氨酸激酶抑制劑影響細胞周期分布的報道，Ling等[7]已證實厄洛替尼通過誘導p27kip1的產生阻止細胞由G1期進入S期，從而實現G1期阻止，Qiong等[4]也發現厄洛替尼能夠使活化T細胞中細胞周期蛋白依賴性激酶（Cyclin-dependent kinase，CDK）抑制劑p27kip1的表達升高。舒尼替尼對細胞周期的影響亦有報道，Yanhong等[8]發現舒尼替尼能夠使T細胞內細胞周期素D3和磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白（Rb）減少，同時CDK6、CDK4磷酸化水平降低，從而實現G1期阻滯。楊彩玲等[9]研究發現鹽酸埃克替尼通過降低人舌鱗狀細胞癌Tca8113，改變Tca8113的細胞周期分布，有明顯的G0/G1期阻滯作用，由此推斷鹽酸埃克替尼可能是通過影響T細胞的周期分布，從而影響T淋巴細胞的增殖。

［1］Shi Y，Zhang L，Liu X，et al.Icotinib versus gefitinib in previously treated advanced non-small-cell lung cancer（ICOGEN）：a random ised，double-blind phase 3 noninferiority trial［J］.Lancet Oncol，2013，14（10）：953-961.

［2］Dietz AB，Souan L，Knutson GJ，et al.Imatinib mesylate inhibits T-cell proliferation in vitro and delayed-type hypersensitivity in vivo［J］.Blood，2004，104（4）：1094-1099.

［3］Schade AE，Schieven GL，Townsend R，et al.Dasatinib，a small-molecule protein tyrosine kinase inhibitor，inhibits T-cell activation and proliferation［J］.Blood，2008，111（3）：1366-1377.

［4］Luo Q，Gu Y，Zheng W，et al.Erlotinib inhibits T-cellmediated immune response via down-regulation of the c-Raf/ERK cascade and Akt signaling pathway［J］.Toxicol A，2011，251（2）：130-136.

［5］Tan F，Shen X，Wang D，et al.Icotinib（BPI-2009H），a novel EGFR tyrosine kinase inhibitor，displays potent efficacy in preclinical studies［J］.Lung Cancer，2012，76（2）：177-182.

［6］Zhao Q，Shentu J，Xu N，et al.Phase I study of icotinib hydrochloride（BPI-2009H），an oral EGFR tyrosine kinase inhibitor，in patients with advanced NSCLC and other solid tumors［J］.Lung Cancer，2011，73（2）：195-202.

［7］Ling Y H，Li T，Yuan Z，et al.Erlotinib，an effective epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，induces p27KIP1 up-regulation and nuclear translocation in association with cell growth inhibition and G1/S phase arrest in human non-small-cell lung cancer cell lines［J］.Mol Pharmacol，2007，72（2）：248-258.

［8］Gu Y，Zhao W，Meng F，et al.Sunitinib impairs the proliferation and function of human peripheral T cell and prevents T-cell-mediated immune response in mice［J］. Clin Immunol，2010，135（1）：55-62.

［9］楊彩玲，韓新光，于春亞.鹽酸埃克替尼對人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞周期及Cy-clinD1、P27表達的影響［J］.鄭州大學學報（醫學版），2011，25（1）：82-85.

The Effect of Icotinib on the Proliferation of T Lymphocyte

Han Guiliang Shi Yan Ren Guanying Wang Xiaolei

（Department of Oncology；Affiliated Hospital of Hebei University，Baoding 071000，China）

ObjectiveTo observe the effect of tyrosine kinase inhibitor（TKI）such as icotinib on T lymphocyte.MethodsTlymphocytes were selected from peripheral blood mononuclear cells by immunomagnetic cell sorting.Then the T lymphocytes were stimulated by Phorbol-12-myristate-13-acetate（PMA）and increasing dose of icotinib was added to the experimental group.After culturing 48-72 hours the proliferation rate of the T lymphocytes was analyzed by MTT.ResultsWe compared the inhibitory rate between the control group and experiment group，and we found that icotinib can inhibit the proliferation of T lymphocyte.ConclusionIcotinib can inhibit the proliferation of T lymphocyte.

Targeted therapy；Tyrosine kinase inhibitor；Tumor immunology

R453

A 學科分類代碼：32067

1001-8131（2016）06-0639-02

2016-07-18