產超廣譜β-內酰胺酶肺炎克雷伯菌研究進展

吳瑤瑤綜述 張湘燕審校

(1.遵義醫學院，貴州 遵義563003；2.貴州省人民醫院呼吸內科，貴州 貴陽 550002 )

·綜 述·

產超廣譜β-內酰胺酶肺炎克雷伯菌研究進展

吳瑤瑤1綜述 張湘燕2審校

(1.遵義醫學院，貴州 遵義563003；2.貴州省人民醫院呼吸內科，貴州 貴陽 550002 )

肺炎克雷伯菌； 產超廣譜β-內酰胺酶； 耐藥性； 感染

感染性呼吸系統疾病不僅是臨床上最常見的疾病之一，也是最常見的致死原因之一，導致了巨大的社會負擔和經濟負擔，因此病原菌感染與抗感染治療長期以來不僅是一個關系重大的社會問題，也是呼吸系統和其他相關臨床及基礎-臨床領域密切關注的課題。產超廣譜β-內酰胺酶肺炎克雷伯菌目前已在全世界范圍內流行，且多重耐藥菌株所占比例高，使臨床治療面臨巨大挑戰。因此，掌握產超廣譜β-內酰胺酶菌株的流行病學特征、耐藥的特點及相關檢測方法，對有效地進行預防和控制至關重要。本篇文章就相關研究進展作一綜述。

肺炎克雷伯菌是人體口咽部常見腸桿菌科寄殖菌之一，在高齡患者、勞累、酗酒或合并各種基礎疾病時易誘發下呼吸道感染[1]。近年來，隨著抗菌藥物使用日益增多，尤其是三代頭孢菌素類藥物的不合理使用導致細菌對這些藥物產生了耐藥，特別是產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)的細菌因其耐藥譜廣、所攜帶的耐藥基因易于傳播而備受關注。一項多中心研究中收集了北京、安徽、福建等6個地區下呼吸道感染耐藥KP，多耐藥菌株比例高達34.2%，耐藥菌株呈現比例高、種類多、分布廣、抗藥性強的特點[2]。它的廣泛流行使得臨床抗感染治療在抗生素選擇方面越來越受限制，已成為目前有效治療細菌感染的一個關鍵性問題[3-5]。這類細菌的耐藥機制主要有以下3個途徑：抗生素水解酶基因的獲取、抗生素靶位點及膜蛋白基因突變、特點基因的差異性表達[6-7]。產生各種使抗生素失活的酶是KP臨床分離菌株耐藥的重要機制和環節[8]。

1 ESBLs的定義、來源和類型

1.1 定義與來源

超廣譜β-內酰胺酶是指可水解包括單環β-內酰胺酶類抗生素和第三代頭孢菌素在內的β-內酰胺類抗生素，并可被β-內酰胺酶抑制劑所抑制的一類β-內酰胺酶[9]。這類酶主要由質粒介導，廣泛發現于大腸桿菌、陰溝腸桿菌及肺炎克雷伯菌等腸桿菌科中。

1.2 ESBLs的分類

根據Bush功能分類法[10]和Ambler的分子結構分類法[11]，ESBLs大部分屬于Bush功能分類中的2be群，Ambler分類法中 A類，少數屬于Bush 2d群、Ambler D類[10-11]。全球目前已經發現200多種ESBLs[12]。根據各個酶特性的不同，大致分為：SHV型、CTX-M型、TEM型、OXA型和其他類型如：PER、VEB、GES、SPO等。

1.2.1 SHV型ESBLs SHV在肺炎克雷伯菌中20%由質粒介導的氨芐西林耐藥是因為SHV-1[13]。SHV-1 β-內酰胺酶的變異位點為Gly238Ser和Glu240Lys，突變后分別對頭孢他啶和頭孢噻肟產生高效水解能力。其主要發現于陰溝腸桿菌、大腸埃希氏菌等細菌中。

1.2.2 CTX-M型ESBLs 該型酶對頭孢噻肟的水解能力明顯高于頭孢他啶，故以Cefotaxime而命名為CTX-M。CTX-M型酶與TEM、SHV型酶同源性僅有39%[14]。最新研究[15-16]表明，該酶與Kluyvera ascorbate菌染色體上的AmpC酶具有更高的同源性。該酶對酶抑制劑敏感，但敏感程度有差別：他唑巴坦>克拉維酸>舒巴坦。對頭孢他啶酶活性弱是多數CTX-M型ESBLs區別于TEM型、SHV型ESBLs的主要標志。CTX-M型ESBLs主要通過整合子、插入序列(ISEcpl)等方式在菌株間發生傳播與擴散。

1.2.3 TEM型ESBLs TEM型ESBLs主要發現于肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌。在TEM-1和TEM-2的編碼基因上的突變形成了該類型的酶，其主要的突變位點為Glu104Lys、Arg164Ser/His、Gly238Ser、Glu240Lys。TEM-2是TEM-1的第1個突變產物，兩者等電點發生了變化，但酶底物譜未發生變化[17]。TEM-3與TEM-1相比：Glu104Lys、Gln39Lys、Gly238Ser，使得原有的特異性酶底物譜擴大，對β-內酰胺酶類抗生素及第三代頭孢菌素產生廣泛耐藥[18]。

1.2.4 OXA型ESBLs OXA型ESBLs對OXA有很強的水解能力，故命名為OXA。該型酶屬分子分類法中的D類和功能分類法中的2 d功能亞組，主要以對苯唑西林和氯唑西林的高水解性、對頭孢菌素的水解能力不一、活性可被克拉維酸輕度抑制為特征。OXA型ESBLs主要為OXA-10，其水解頭孢菌素的能力有所提高，較少被克拉維酸所抑制，其中第72位上絲氨酸被天冬酰胺所替代，第157位上的天冬氨酸代替甘氨酸，這兩者的變化決定著ESBLs表型的呈現。OXA型酶主要存在于肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌及其他腸桿菌科細菌[5，19-20]。

1.2.5 其他類型ESBLs 其他的ESBLs有PER、VEB、MEN、TLA等。最新研究表明，在世界范圍內不同地區陸續發現了除腸桿菌科外的其他菌種還存在有不同型別的ESBLs，如SFO、CME、GES、FEC等。這些酶均具有較強的水解頭孢他啶和氨曲南的能力。

2 ESBLs分子流行病學分布特征

ESBLs的首次報道是在1983年德國，被發現于肺炎克雷伯菌和黏質沙雷菌中，近30年間，產ESBLs菌株已大范圍出現在世界各地。但因各個國家、地區、醫院使用的抗菌藥物種類不同、細菌流行種類以及自然環境等不同，其檢出率、基因型的分布在不同國家、不同地區和不同醫院間也有很大差別。西班牙產ESBLs菌株具有高度多樣性，但以CTX-M-9、CTX-M-10、CTX-M-14及TEM-4型最多見[21]；在美國則以TEM-10、TEM-26和TEM-12為主；英國以TEM-10和TEM-12為主；韓國以SHV-12、TEM-52和SHV-2a為主；OXA型主要分布于法國及土耳其；近年來CTX-M型在逐年增加，現已在全世界范圍內呈流行趨勢[22]。我國的ESBLs以CTX-M型及SHV型為主，常見的為CTX-M-14、CTX-M-9、CTX-M-3和SHV-12等。醫院ESBLs檢出率較高的科室為呼吸科、老干病房及ICU病房。主要原因：這些病房患者多合并有基礎疾病、免疫力差，可能存在有免疫抑制劑的使用以及侵襲性操作等因素；在分子學方面，ESBLs基因位于質粒上，可通過接合轉移、轉座和轉導等方式使耐藥性發生傳遞。

3 ESBLs的檢測方法

美國國家臨床實驗室標準化研究所(CLSI)對肺炎克雷伯菌產ESBLs初篩和表型確證試驗作如下推薦[23]。

3.1 表型初篩試驗

標準紙片擴散法：選擇頭孢他啶、氨曲南、頭孢噻肟、頭孢泊肟或頭孢曲松(每片含量均為30 μg)，采用M-H瓊脂平皿測試抑菌環直接，當頭孢他啶≤22 mm或氨曲南≤27 mm或頭孢噻肟≤28 mm或頭孢泊肟≤17 mm或頭孢曲松≤25 mm時，提示菌株可能產ESBLs。

該法簡單易于操作，但特異性較差，因ESBLs對不同底物的水解能力不同，部分菌株在藥敏試驗中對單環類及頭孢菌素類抗生素表現為敏感或中介，因此容易造成漏檢。故該法僅能作為初篩試驗，進一步證實還需進行表型確證試驗。

3.2 表型確證試驗

3.2.1 紙片表型確證試驗 將待測菌制成濁度為0.5麥氏單位的菌懸液，用棉棒均勻涂布于M-H平皿上，把頭孢他啶、頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟、頭孢噻肟/克拉維酸藥敏紙片貼在平皿上。35 ℃孵育18～24 h后觀察結果。判定標按2009年版NCCLS(美國臨床實驗室標準化委員會)標準：頭孢噻肟/頭孢噻肟加克拉維酸、頭孢他啶/頭孢他啶加克拉維酸，對照不加克拉維酸組抑菌圈直徑≥5 mm為產酶株，即ESBLs陽性。該法簡單、經濟，常作為實驗室常規檢測。

3.2.2 E-test法 將頭孢他啶以及復方制劑頭孢他啶/克拉維酸分別置于試條兩端，并將試條貼于受檢菌株的M-H瓊脂平板上，經35 ℃孵育18～24 h后，讀取試條兩端的MIC值≥8即可判定產ESBLs，否則為陰性。該方法更為敏感和特異，可讀出具體MIC值，因此結論較為客觀；缺點為試條價格昂貴，且試條上抗生素濃度梯度有限，有造成漏檢的可能。

3.2.3 等電聚焦電泳 對未知的ESBLs進行等電聚焦電泳，將檢測結果與已知酶的等電點(PI)進行比較，若相同則可能為同一種類，若不同可能為一種新的ESBLs。已知SHV型的PI一般在7.0～7.8；而TEM型的PI多在5.2～6.3；非SHV型非TEM型的PI高低不等。因此有些酶的等電點在相同或相近時難以用該法進行區別。

4 小 結

近30年間，產ESBLs的肺炎克雷伯菌在全世界范圍內廣泛流行，并且不斷有新的產ESBLs菌株出現，各種ESBLs的特性有所差別。產ESBLs菌株可通過產酶基因的水平傳播(如整合、轉化、轉導等)和產酶株的克隆傳播造成耐藥性的擴散及院內感染的流行。快速、準確的檢測產ESBLs菌株對臨床治療、院內感染的控制有著重要意義，目前檢測手段有多種，可根據各自優缺點靈活選擇。全面客觀的評價產ESBLs的肺炎克伯菌菌株的耐藥性特點，對臨床上抗生素的合理使用有著重要意義，可減少新的產酶菌株的產生。

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