Slug 、細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子和E-鈣黏蛋白在唾液腺腺樣囊性癌中的表達及意義

徐娟

（山東省菏澤市立醫院 口腔科，山東 菏澤 274000）

唾液腺腺樣囊性癌（salivary gland adenoid cystic carcinoma, SACC）是臨床上較為常見的唾液腺惡性腫瘤，發病率占唾液腺惡性腫瘤的20%左右[1]。其具有發展緩慢、易轉移及侵襲神經等特點，引起相關專家學者的研究。目前隨著科技的不斷進步，有研究顯示，Slug、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）以及細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN）與肝癌的轉移、侵襲及發生、發展具有重要關系[2]。Slug是一種轉錄因子，被認為與惡性腫瘤的侵襲性關系密切。EMMPRIN被認為與惡性腫瘤的耐藥性、轉移及生長等有著重要聯系。E-cadherin則是一種黏附蛋白，可以抑制細胞的上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT） 過 程，而EMT在惡性腫瘤的發生發展中又有重要作用。因此人們認為，Slug、EMMPRIN和E-cadherin在SACC中也具有重要地位[3-4]。本文采用免疫組織化學染色法結合SACC組織的病理特征，檢測Slug、EMMPRIN和E-cadherin的表達結果，分析Slug、EMMPRIN和E-cadherin的表達與SACC病理特征的聯系以及三者相互之間的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取該院2012年5月-2015年6月期間收治的96例SACC患者手術中切除的病理標本，患者手術前均未進行抗腫瘤治療，病理資料保存完整。其中，男42例，女54例；年齡42～85歲，平均（61.4±3.5）歲。發生部位：大唾液腺50例，小唾液腺46例。唾液腺腫瘤組織分型：篩狀型及管狀型（統稱篩管型）68例，實性型28例。惡性腫瘤TNM（tumor node metastasis）分期：其中Ⅰ期患者19例，Ⅱ期患者21例，Ⅲ期患者30例，Ⅳ期患者26例。確認神經侵襲病例32例，未發生神經侵襲病例64例。轉移病例19例，未轉移病例77例。復發病例31例，未復發病例65例。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 一抗：由Abcam生產的兔抗人多克隆Slug抗體；由Santa Cruz生產的兔抗人多克隆EMMPRIN抗體；由Bioss生產的兔抗人多克隆E-cadherin抗體。二抗：由中杉金橋生產的SP- 9001試劑盒。

1.2.2 檢測方法 將所有標本甲醛固定、石蠟包埋并制成4 μm切片。使用鏈霉菌親和素-過氧化物酶（streptavidin-perosidase, SP）三步法檢測切片組織中Slug、EMMPRIN以及E-cadherin的表達，使用二甲苯浸泡標本使標本脫蠟，梯度乙醇水化，放入3% H2O2，在室溫下孵育15 min，消除過氧化物酶活性。將標本置于濃度為0.01 mol/L的枸櫞酸鈉緩沖液中煮沸15 min，將煮沸的標本進行20 min自然冷卻，后加快冷卻至室溫，并使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）液洗滌3次，3 min/次。滴入山羊抗兔二抗工作液（IgG/ Bio），生物素標記，30 min室溫孵育。滴入鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP），30 min室溫孵育。后再次使用PBS洗滌3次，3 min/次。二氨基聯苯胺（diaminobenzidine, DAB）顯色，蘇木精染色，乙醇脫水，干燥，樹膠封片。以PBS代替一抗滴入作為空白對照組。

1.3 觀察指標

觀察唾液腺腺樣囊性癌組織中Slug、EMMPRIN和E-cadherin表達情況，分析三者與SACC病理特征的關系。觀察三者間相關性情況。免疫組化結果由本院2名檢驗科資深醫師進行檢驗，顯微鏡方法倍數400倍，視野中出現棕黃色顆粒細胞為陽性細胞。以陽性細胞數量計算組織病理特征。視野計數陽性細胞低于5%為陰性；視野計數陽性細胞等于5%～50%為弱陽性；視野計數細胞大于50%為陽性。

1.4 統計學方法

應用SPSS 18.0軟件對數據進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差（±s）差表示，行t檢驗；計數資料采用百分比（%）表示，行χ2檢驗；采用Fisher概率檢驗對三者間相關性進行分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Slug、EMMPRIN和E-cadherin在SACC中的表達情況

Slug為強陽性表達，表達率高達77.08%；EMMPRIN為強陽性表達，表達率為68.75%；E-cadherin為弱陽性表達，表達率為52.08%。見表1。

表1 Slug、EMMPRIN和E-cadherin在SACC中的表達情況 例（%）

2.2 Slug、EMMPRIN和E-cadherin在SACC中的表達與SACC病理特征的關系

SACC組 織 中 Slug、EMMPRIN和 E-cadherin的表達性別、年齡與部位比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；Slug、EMMPRINⅢ、Ⅳ期陽性率與Ⅰ、Ⅱ期陽性率比較差異有統計學意義（P＜0.05）；Slug、EMMPRIN實性型陽性率分別為91.43%、94.29%，Slug、EMMPRIN篩管型陽性率分別為68.86%、54.10%，Slug、EMMPRIN實性型陽性率明顯高于篩管型陽性率（P＜0.05）；Slug有神經侵襲、轉移和復發的陽性率分別為93.75%、91.67%和90.32%，Slug無神經侵襲、轉移和復發的陽性率分別為68.75%、68.33%和70.77%，EMMPRIN有神經侵襲、轉移和復發的陽性率分別為93.75%、97.22%和87.10%，EMMPRIN無神經侵襲、轉移和復發的陽性率分別為56.25%、51.67%和60.00%，Slug、EMMPRIN有神經侵襲、轉移和復發的陽性率明顯高于無神經侵襲、轉移和復發（P＜0.05）；E-cadherin在Ⅰ、Ⅱ期的陽性率明顯高于Ⅲ、Ⅳ期（P＜0.05）；E-cadherin篩管型的陽性率明顯高于實性型（P＜0.05）；E-cadherin無神經侵襲、轉移和復發的陽性率明顯高于有神經侵襲、轉移和復發（P＜0.05）。見表 2。

表2 Slug、EMMPRIN和E-cadherin在SACC中的表達與SACC病理特征的關系 （n =96）

2.3 Slug、E MMPRIN在SACC中表達的相關性分析

SACC中Slug的表達與EMMPRIN呈明顯正相關（r=0.836,P=0.002）。見表3。

2.4 Slug、E-cadherin在SACC中表達的相關性分析

SACC中Slug的表達與E-cadherin呈明顯負相關（r=-0.542,P=0.025）。見表4。

2.5 EMMPRIN、E-cadhe rin在SACC中表達的相關性分析

SACC中EMMPRIN的表達與E-cadherin呈明顯負相關（r=-0.461,P=0.031）。見表5。

表3 Slug、EMMPRIN在SACC中的表達相關性分析 （n =96）

表4 Slug、E-cadherin在SACC中表達的相關性分析 （n =96）

表5 EMMPRIN、E-cadherin在SACC中表達的相關性分析 （n =96）

3 討論

SACC是一種臨床上唾液腺較為常見的惡性腫瘤，具有較強的侵襲性和轉移性。與大多數惡性腫瘤相同，SACC手術治療效果較佳，但對于SACC患者術前術后的病理分析較為重要，如何采取可靠的觀察指標觀察患者術后的預后情況是關鍵。隨著醫學的不斷進步和發展，越來越多的腫瘤指標物被人們挖掘出來，成為腫瘤患者預后的重要指標，為臨床腫瘤病人預后的評估奠定了依據。為進一步研究SACC轉移、侵襲等過程，本文對SACC組織進行研究，觀察Slug、EMMPRIN以及E-cadherin在SACC中表達情況，分析與病理特征的關系以及三者互相的關系。

Slug屬于鋅指轉錄因子家族，是一種具有鋅指結構的上皮-間質轉化轉錄因子，在腫瘤EMT過程中起到重要作用，最初學者發現其參與了神經胚的形成和發育。隨著腫瘤發病率的不斷升高，人們又在惡性腫瘤中發現了Slug的身影，而在惡性腫瘤中，Slug一般表現為過度表達，引起了相關專家學者的興趣[5]。隨后研究發現，Slug在惡性腫瘤EMT過程中具有重要作用，且參與了惡性腫瘤的轉移和侵襲[6]。在本文中對SACC組織中Slug的表達進行檢測，結果發現Slug在SACC中呈現強陽性表達，表達率高達77.08%，顯著高于Tang等[7]研究正常唾液腺組織中陽性表達率的0%（0/10）。本文觀察Slug與病理特征關系的研究中發現，Slug在Ⅲ、Ⅳ期的陽性率明顯高于Ⅰ、Ⅱ期，實性型的陽性率明顯高于篩管型，有神經侵襲、轉移、復發的陽性率明顯高于無神經侵襲、轉移、復發（P＜0.05）。同時證實了Slug在SACC中發生、發展、轉移復發以及侵襲中的重要性。

EMMPRIN是免疫球蛋白家族中的一員，是跨膜糖蛋白的一種，研究人員首次在腫瘤細胞和成纖維細胞中發現[8]。有研究顯示EMMPRIN可誘導部分基質金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinase, MMPs）的表達[9]。EMMPRIN通過刺激成纖維細胞降解細胞外基質和基底膜，從而增強腫瘤細胞的侵襲力和轉移能力。在正常細胞中，EMMPRIN位于細胞膜上，而當EMMPRIN轉移至細胞質中時會誘導MMPs的表達。謝宏亮等[10]的研究中使EMMPRIN沉默表達，結果發現惡性腫瘤的侵襲力明顯降低，體現了EMMPRIN參與了惡性腫瘤細胞的轉移和侵襲。本文中研究結果顯示，EMMPRIN在SACC組織中呈強陽性表達，表達率高達68.75%。結果顯示EMMPRIN可能是通過調節MMPs的表達從而達到增強惡性腫瘤細胞侵襲力的結果。本文中還顯示，EMMPRIN在Ⅲ、Ⅳ期的陽性率明顯高于Ⅰ、Ⅱ期，實性型的陽性率明顯高于篩管型，有神經侵襲、轉移和復發的陽性率明顯高于無神經侵襲、轉移和復發（P＜0.05）。同樣證實了其在SACC中的重要性和影響。

E-cadherin是鈣黏附蛋白的一種，主要功能是介導細胞之間的互相黏附，在以往作為EMT的重要標志[11]。E-cadherin的下調會使細胞發生EMT，使細胞喪失細胞極性和細胞間連接，從而導致細胞形態結構向間質細胞的特征轉化，使腫瘤細胞具備了轉移能力[12]。目前對大腸癌、前列腺癌、肝癌及肺癌等多數研究均發現E-cadherin的表達明顯下調，表明EMT在多種惡性腫瘤中均起到重要作用[13-14]。因此本文對SACC組織進行檢測，結果發現E-cadherin在SACC組織中呈弱陽性，陽性表達率僅為52.08%，遠低于駱一西等[15]研究的正常唾液腺組織中表達的100%。本文還發現E-cadherin與病理特征的關系與Slug、EMMPRIN不同，在Ⅰ、Ⅱ期的陽性率明顯高于Ⅲ、Ⅳ期，篩管型的陽性率明顯高于實性型，無神經侵襲、轉移和復發的陽性率明顯高于有神經侵襲、轉移和復發（P＜0.05）。

本文還進一步研究了Slug、EMMPRIN和E-cadherin三者在SACC中的表達情況，結果發現，SACC中Slug的表達與EMMPRIN呈明顯正相關（r=0.836,P＜0.05）；Slug的表達與E-cadherin呈明顯負相關（r=-0.542,P＜0.05）；EMMPRIN的表達與E-cadherin呈明顯負相關（r=-0.461,P＜0.05）。

綜上所述，本文對Slug、EMMPRIN和E-cadherin三者在SACC中的表達做了深入分析，發現三者與SACC病理特征關系密切，Slug、EMMPRIN表達與SACC呈正相關性，E-cadherin表達與SACC呈負相關性。因此三者表達的聯合檢測可能成為對SACC的疾病程度、預后等評估的有效指標。

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