過表達miRNA-291b-3p誘導H9C2細胞胰島素抵抗

隋小芳，李雪杰，王鳳玲*，索樹珍，楊　軍，董天崴，張磊藝

(1.佳木斯大學附屬第一醫院 老年病科；2.佳木斯大學老年醫學研究生;

3.佳木斯大學附屬第一醫院 心內科，黑龍江 佳木斯154002)

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過表達miRNA-291b-3p誘導H9C2細胞胰島素抵抗

隋小芳1，李雪杰2，王鳳玲1*，索樹珍2，楊軍3，董天崴3，張磊藝3

(1.佳木斯大學附屬第一醫院 老年病科；2.佳木斯大學老年醫學研究生;

3.佳木斯大學附屬第一醫院 心內科，黑龍江 佳木斯154002)

摘要：目的研究過表達miRNA-291b-3p對誘導H9C2細胞胰島素抵抗的影響。方法①用10 ng/ml TNF-α處理心肌細胞系H9C2細胞24 h，通過Real time PCR檢測 miR-291b-3p表達水平，Western blot 分析AKT/GSK信號通路活性，用蒽酮法檢測細胞糖原水平；②構建miR-291b-3p mimics 腺病毒載體，感染H9C2細胞48 h，分析miR-291b-3p水平、AKT/GSK 信號通路活性和糖原水平的變化。結果①TNF-α處理H9C2細胞24 h，miR-291b-3p 的表達水平明顯升高，同時AKT/GSK信號通路活性受到抑制，心肌細胞糖原水平升高；②miR-291b-3p mimics腺病毒感染H9C2細胞48 h，miR-291表達水平升高，AKT/GSK信號通路活性降低，心肌細胞糖原水平升高。結論H9C2細胞中TNF-α或過表達miR-291b-3p可抑制AKT/GSK 信號通路活性，出現胰島素抵抗。

關鍵詞：心肌細胞；胰島素抵抗；miR-291b-3p；TNF-α

(ChinJLabDiagn,2016,20:0182)

近幾年研究發現，胰島素抵抗(I R)在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的發生和進展過程中起到至關重要的作用,是連結多種代謝性異常和心血管疾病的中心環節[1]。隨著對miRNAs的深入研究，越來越多的結果表明，miRNAs廣泛參與人類疾病的發生過程[2]。最近研究表明，miRNA 參與調控心血管系統的發育和疾病發生過程。在心肌胰島素抵抗中miRNAs發揮的作用及其機制尚不明確。深入探討這些miRNA在疾病發生發展中的作用，將有助于我們對疾病的認知，并為疾病的治療提供新的治療思路及靶點。

1材料與方法

1.1細胞及主要材料來源

實驗用H9C2大鼠心肌細胞株，購自中國醫學科學院細胞庫。H-DMEM 培養基購自Invitrogen公司； 胎牛血清購自美國Hyclone公司；TNF-α 購于美國Epitomics公司；AKT抗體、Ser473磷酸化AKT抗體、GSK抗體、Ser9磷酸化 GSK抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；二抗(HRP標記的羊抗兔)購自北京中杉金橋生物技術有限公司。miR-291b-3p 過表達腺病毒載體(AD-291b-3p mimic)構建與純化交由上海吉凱科技有限公司完成。肌/肝糖原檢試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.2大鼠心肌細胞的培養

H9c2細胞用含10%胎牛血清的H-DMEM培養基于37 ℃、5%CO2培養箱內培養，每2天更換培養液一次，細胞達約80%-90%豐度時，用0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3比例接種于新培養瓶中傳代或六孔板中用于實驗。

1.3細胞模型的建立

將狀態良好的細胞接種于6孔板中，隨機分為4組:正常對照組，未進行處理；TNF-α處理組，10 ng/ml TNF-α處理24 h；miR-291b-3p 表達的對照組(NC 組)，miR-291b-3p 表達組(Ad-291m組)。

1.4miR-291b-3p表達檢測

收集上述細胞模型，應用實時熒光定量PT-PCR檢測。采用Trizol試劑提取細胞RNA，取1μgRNA逆轉錄 miRNA合成cDNAR，反轉錄產物采用SYBR Green熒光定量試劑盒和熒光定量PCR儀行PCR。PCR 反應完畢后分析產物融解曲線判斷反應的特異性，采用△循環閾值(Ct)法處理結果，計算相對表達量即2-△△ct。引物設計如下：

引物名稱反轉錄引物序列5’-3’miR-291b-3pGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-TCGCACTGGATACGACACAAACU6GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-TCGCACTGGATACGACAAATATG

引物名稱PCR引物序列5’-3’miR-291b-3pGCAAAGTGCATCCATTTTGTTTGTU6GCGCTCGTGAAGCGTTCUniverseprimerGTGCAGGGTCCGAGGT

1.5觀察miR-291b-3p水平變化對胰島素抵抗的影響

應用AD-291b-3p mimic及其陰性對照，分別感染H9C2細胞48 h后，收集細胞，用TRIzol提取總RNA，用特異性microRNA 反轉錄引物反轉錄1 μg RNA；應用real time PCR檢測miR-291b-3p水平；用細胞裂解液提取細胞總蛋白，Western blot檢測p-AKT、AKT、p-GSK、GSK水平；按肌、肝糖原檢試劑盒說明操作，檢測心肌細胞中糖原水平。

1.6統計學分析

應用SPSS 13.0統計軟件，采用t檢驗和單因素方差分析進行數據處理。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1TNF-α上調H9C2細胞中miR-291b-3p的表達水平，引起心肌胰島素抵抗

10 ng/ml TNF-α處理H9C2細胞24 h，構建心肌胰島素抵抗模型。根據Real time PCR檢測結果顯示，與對照組相比，TNF-α處理組中miR-291b-3p表達水平(圖1A)升高2.8倍左右。同時，western blot的結果顯示，TNF-α處理組中，AKT和GSK的磷酸化水平降低(圖1C)，糖原水平明顯升高(圖1B)。上述結果提示，TNF-α 能夠抑制胰島素信號活性，引起H9C2細胞胰島素抵抗；miR-291b-3p可能參與其中。

A.miR-291b-3p的表達水平；B.糖原水平；C.western blot檢測AKT/GSK通路的蛋白水平(n=3,*P<0.5,**<0.01)

圖1TNF-α處理H9C2細胞引起胰島素抵抗

2.2過表達miR-291b-3p 抑制細胞AKT/GSK 信號通路活性

在H9C2細胞中，我們用AD-291b-3p mimics腺病毒感染H9C2細胞 48 h。結果顯示miR-291b-3p表達水平明顯升高(圖2A)，AKT和GSK磷酸化水平降低，細胞中糖原水平顯著升高(圖2B，C)。由此可見，過表達miR-291b-3p能夠抑制AKT/GSK信號通路活性，引起胰島素抵抗。

A.miR-291b-3p的表達水平；B.糖原合成水平；C.western blot檢測AKT/GSK通路的蛋白水平(n=3,*P<0.5,**<0.01，***<0.001)

3討論

胰島素抵抗是指機體對胰島素的敏感性和反應性下降，導致正常量的胰島素產生的生物學效應低于正常水平，可表現為葡萄糖攝取減少、糖原合成能力下降[3]。胰島素抵抗不僅是2型糖尿病的主要發病機制，也是心血管疾病發生的危險因素。據統計，在糖尿病患者患有心血管疾病的大約占50%，且大部分死于心血管相關疾病[4]。目前，研究者主要關注肝臟、骨骼肌和脂肪在全身胰島素抵抗中的作用，對心肌細胞胰島素抵抗研究尚少。

炎癥因子是誘發胰島素抵抗的重要因素[5]。在骨骼肌細胞中，TNF-α可通過抑制胰島素刺激葡萄糖吸收時多種相關蛋白，誘發胰島素抵抗，如胰島素受體底物-1(IRS-1)和葡萄糖轉運蛋Et4(GLUT4)。胰島素主要通過激活 PI3K信號通路[6]促進心肌細胞內 GLUT-2及 GLUT-4 表達增加而使心肌細胞葡糖攝取增加[7]。本研究發現，TNF-α處理能夠降低H9C2細胞中AKT/GSK信號通路活性，升高細胞中糖原水平。說明TNF-α能夠導致心肌細胞發生胰島素抵抗。同時，TNF-α能夠降低miR-291b-3p表達水平。提示，miR-291b-3p可能參與TNF-α引起的心肌細胞胰島素抵抗。目前，越來越多的研究表明miRNA 能夠廣泛參與到胰島素信號通路的調控以及葡萄糖穩態的調控中[2]。例如，miR-122[8]、miR-103和 miR-107[9]均參與調節機體胰島素敏感性及糖脂代謝穩態。miR-291b-3p[10]屬于miR-290家族，已有研究證實其參與肝臟胰島素抵抗的AKT/GSK信號通路，該家族包括miR-290-3p、miR-291a-3p、miR-291b-3p、miR-292-3p、miR-291b-5p、miR-294以及miR-295，位于染色體7上的2200 bp的堿基片段，可以調控各種細胞信號通路[11]。在本研究中，我們發現在H9C2細胞中過表達miR-291b-3p能夠抑制AKT/GSK信號通路活性，升高細胞糖原水平。說明miR-291b-3p能夠調節H9C2細胞發生胰島素信號敏感性,其作用與TNF-α一致。

綜上所述，過表達 miR-291b-3p，可抑制AKT/GSK信號通路活性，降低細胞中糖原合成水平。由于miRNA具有特定基因調節的重要功能，有希望為臨床疾病的診斷及治療提供靶點。但是，今后我們還需進一步探討miR-291b-3p調控胰島素信號通路的分子機制及其下游靶基因。

參考文獻：

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MiR-291b-3p regulates activation of insulin signal pathway in H9C2 cellSUIXiao-fang1,LIXue-jie2,WANGFeng-ling1,etal.(1.DepartmentofGeriatrics,theFirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity；2.Geriatrics,theFirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,Postgraduatestudent,Jiamusi154002，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effecte of miRNA-291b-3p on the insulin resistance in H9C2 cells.Methods①H9C2 cells were treated with 10 ng/ml TNF-α for 24 h to induce insulin resistance.And the level of miR-291b-3p,activation of AKT/GSK pathway and the level of glycogen were analyzed.②In order to over-express miR-291b-3p,H9C2 was infected with AD-291b-3p mimices for 48 h.And the level of miR-291b-3p,activation of AKT/GSK pathway and the level of glycogen were analyzed.Results①TNF-α treatment significantly up-regulated miR-291b-3p expression and glycogen level,accompanied by decreased activation of AKT/GSK pathway.②In H9C2 cells Infected with AD-miR-291b-3p mimics,the levels of miR-291b-3p and glycogen level were increased and activation of AKT/GSK pathway was inhibited.ConclusionIn H9C2 clls,TNF-α treatment or over-expression of miR-291b-3p inhibited activation of AKT/GSK pathway.

Key words:Myocardial cell,insulin resistance,miR-291b-3p,TNF-α

(收稿日期：2015-11-20)

作者簡介：隋小芳(1976-)，女，副主任醫師，碩士研究生導師，主要從事老年心血管疾病的臨床與基礎研究；王鳳玲，女(1963-)，教授，碩士研究生導師，主要從事動脈硬化的臨床與基礎研究。

文獻標識碼：A

中圖分類號：Q786

文章編號：1007-4287(2016)02-0182-04

*通訊作者

基金項目:黑龍江省自然基金面上項目(項目編號：H2015076)；黑龍江省中醫藥中青年科技攻關項目(項目編號：ZQG-055)；佳木斯大學研究生科技創新項目(項目編號：LM2015_013)