Gas6在胎盤或蛻膜組織中的表達及其與子癇的相關性

李綺霞，何玉蘭，金玉

(廣州市從化區南方醫科大學第五附屬醫院婦產科，廣東 廣州 510900)

Gas6在胎盤或蛻膜組織中的表達及其與子癇的相關性

李綺霞，何玉蘭，金玉

(廣州市從化區南方醫科大學第五附屬醫院婦產科，廣東 廣州 510900)

目的 探討胎盤或蛻膜組織中生長阻滯特異性蛋白6(Gas6)的表達水平及其與子癇前期的相關性。方法選取2012年6月至2015年4月本院婦產科收治的42例重度子癇前期剖宮產分娩孕婦作為子癇組，42例同期正常晚期妊娠剖宮產孕婦作為對照組，采用免疫組化法分別檢測兩組受檢者胎盤、蛻膜組織中的Gas6蛋白表達水平，采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測胎盤組織Gas6 mRNA的表達，并分析Gas6 mRNA與重度子癇前期患者相關指標的關系。結果子癇組患者的收縮壓、舒張壓和血肌酐(Scr)分別為(163.2±16.4)mmHg、(101.4±9.5)mmHg、(60.4±13.2)μmol/L，均明顯高于對照組的(119.5±8.3)mmHg、(71.6±8.3)mmHg和(41.0±11.9)μmol/L，差異均有統計學意義(P＜0.05)；子癇組患者的白蛋白(30.4±3.9)g/L、血小板(167.3±54.1)×109/L水平顯著的低于對照組的白蛋白(35.1±4.2)g/L、血小板(256.0±83.7)×109/L，差異有統計學意義(P＜0.05)；子癇組患者胎盤、蛻膜組織中Gas6蛋白的表達強度均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)；子癇組患者胎盤組織中Gas6 mRNA的表達水平(0.61±0.23)顯著高于對照組的(0.34±0.18)，差異有統計學意義(P＜0.05)；子癇組患者胎盤組織中Gas6 mRNA的表達水平與患者的收縮壓、舒張壓、Scr呈顯著的正相關(r=0.417、0.382、0.405，P＜0.05)；子癇組患者胎盤組織中Gas6 mRNA的表達水平與白蛋白、血小板水平呈顯著的負相關(r=-0.326、-0.314，P＜0.05)。結論子癇前期患者胎盤或蛻膜組織中Gas6高表達，并且與子癇發病有關。

胎盤；蛻膜組織；生長阻滯特異性蛋白6；子癇前期；相關性

懷孕前血壓正常的孕婦在妊娠20周以后出現高血壓、蛋白尿，稱子癇前期，或稱為先兆子癇，是妊娠期高血壓疾病的五種狀況之一，為妊娠期特發疾病，可影響機體各器官系統，發病率約占全部妊娠的3.9%。子癇前期患者血壓控制不佳可引起嚴重的子癇發作，導致不良妊娠結局的發生[1]。

子癇前期的發病機制較為復雜，妊娠狀態中循環血容量的增加、動脈血管內皮的損傷以及胎盤界面形成不良，或者胎盤母體面的局部炎癥反應等，均可能參與到了子癇前期的發生發展過程[2]。生長阻滯特異性蛋白6(Gas6)是一種生長阻滯特異性基因編碼的分泌性蛋白，其生物學功能與血管的炎癥、免疫以及脂蛋白的代謝有關[3-4]。本次研究重在探討胎盤或蛻膜組織中Gas6的表達水平及與子癇前期的發病關系，進而進一步揭示子癇前期的發病機制，并為患者的臨床預后提供新的生化指標參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年6月至2015年4月收治的42例重度子癇前期在本院產科實施剖宮產分娩孕婦作為子癇組，同期正常孕晚期妊娠的在本院實施剖宮產的42例婦女作為對照組。子癇組孕婦年齡26～38歲，平均(31.6±3.8)歲，孕次(2.3±1.2)次，產次(1.4±0.4)次。對照組孕婦年齡24～36歲，平均(31.2±3.4)歲，孕次(2.2±1.3)次，產次(1.3±0.5)次。兩組孕婦的年齡、孕次、產次構成等差異均無統計學意義(P＞0.05)。

1.2 納入排除標準

1.2.1 納入標準 (1)重度子癇前期婦女的診斷標準主要依據樂杰主編《婦產科學》第七版中的標準；(2)實驗室診斷滿足：收縮壓/舒張壓≥160/110 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)、尿蛋白≥2.0/24 h；(3)對照組孕婦來源于同期正常孕晚期妊娠的剖宮產的婦女；(4)本研究取得研究對象的知情同意并簽訂協議書。

1.2.2 排除標準 (1)既往具有高血壓、糖尿病、慢性肝腎功能損害的患者；(2)具有精神病史的患者；(3)合并免疫系統疾病或正在使用糖皮質激素、免疫制劑的患者；(4)合并其他妊娠合并癥的患者。

1.3 Gas6蛋白的免疫組化 組織采用石蠟包埋，切片機切取組織，厚度5 mm，用多聚賴氨酸處理。在脫蠟之前，將切片置于60℃恒溫箱中烘烤60 min。將切片用二甲苯浸泡10 min，更換二甲苯后再浸泡10 min。水化后進行抗原修復，3%H2O2一甲醇溶液處理切片15 min，加入一抗Fascin鼠單抗100 L，37℃，濕盒孵育1 h。加入增強劑50 L，室溫濕盒孵育20 min。加入辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗50 L，室溫37℃，孵育30 min。每張片子加2滴新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察。FHS-2R光學顯微鏡購自羅氏檢測公司，相關配套試劑購自南京凱基生物科技有限公司。

1.4 RT-PCR 取凍存已裂解的組織沖洗液，按照10 000 r/min的離心速度進行離心分離，每1 mL的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 mL的氯仿，進行裂解操作，4℃冰上采用無酶的RNA沖洗液進行洗滌，再次10 000 r/min離心5 min，得到RNA。混合液在加入逆轉錄酶MMLV之前先70℃干浴3 min，取出后立即冰水浴至管內外溫度一致，然后加逆轉錄酶0.5 μL，37℃水浴60 min，室溫放置5 min使其完全溶解，使其逆轉錄為cDNA。以β-actin為模版，在反應體系中加入SYBR Green 1染料、上游引物、下游引物、dNTP，使得總體積達20 μL，上機，反應條件為：93℃2 min、93℃1 min、55℃2 min，共40個循環。引物設計：上游3'-5'，ATGCCGCCTCGCTGAA，5'-3'，GGCAGCGAGGCGGCTA，引物購自上海華生科技有限公司。

1.5 觀察指標及評價標準 對比兩組胎盤、蛻膜組織中Gas6蛋白、mRNA、收縮壓、舒張壓、D-二聚體、血肌酐(Scr)、血漿白蛋白、血小板計數的差異。免疫組化結果評價標準：Gas6蛋白在胎盤組織中主要定位于合體滋養層細胞的細胞質和細胞核中，在蛻膜組織中主要定位細胞質和細胞核中，呈黃色、棕黃色、褐色表達。(1)根據著色強度：0分為無色、1分為淡黃色、2分為棕黃色、3分為褐色、黑色；(2)根據陽性細胞比例：陽性細胞數目所占比例＜10%為1分、陽性細胞所占比例11%～50%為2分、陽性細胞數51%～75%為3分、陽性細胞數所占比例＞75%為4分，(-)為總分＜3分，陰性表達；(+)為3～5分，弱陽性表達；(++)為6～9分，中陽性表達；(+++)為＞9分，強陽性表達。

1.6 統計學方法 數據分析在SAS9.3軟件包中處理，正態分布的計量指標采用均數±標準差(±s)表示，兩組間比較采用t假設檢驗；等級計數資料組間比較采用秩和檢驗；相關性分析法采用Pearson線性相關法；P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 子癇組和對照組的相關臨床指標比較 子癇組患者的收縮壓、舒張壓、Scr水平顯著的高于對照組患者(P＜0.05)，子癇組患者的白蛋白、血小板水平顯著的低于對照組患者(P＜0.05)；兩組間D-二聚體差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 子癇組和對照組的相關臨床指標比較(±s)

表1 子癇組和對照組的相關臨床指標比較(±s)

組別子癇組對照組t值P值例數42 42收縮壓（mmHg）163.2±16.4 119.5±8.3 15.408＜0.001舒張壓(mmHg) 101.4±9.5 71.6±8.3 15.309＜0.001 D-二聚體(mg/L) 2.7±1.4 2.3±1.1 1.456 0.094 Scr(umol/L) 60.4±13.2 41.0±11.9 7.074＜0.001白蛋白(g/L) 30.4±3.9 35.1±4.2 5.314＜0.001血小板(109/L) 167.3±54.1 256.0±83.7 5.797＜0.001

2.2 胎盤和蛻膜組織中Gas6蛋白的表達情況 子癇組患者胎盤、蛻膜組織中Gas6蛋白的表達水平均顯著高于對照組(P＜0.05)，見表2、3和圖1。

表2 子癇組和對照組蛻膜組織中Gas6蛋白的表達水平[例（%）]

表3 子癇組和對照組胎盤組織中Gas6蛋白的表達水平[例（%）]

圖1 免疫組化結果

2.3 胎盤組織中Gas6 mRNA的表達情況 子癇組患者胎盤組織中Gas6 mRNA的表達水平均顯著高于對照組(P＜0.05)，見表4，圖2。

表4 兩組胎盤組織中Gas6 mRNA的表達水平(±s，吸光度值)

表4 兩組胎盤組織中Gas6 mRNA的表達水平(±s，吸光度值)

組別 例數Gas6 mRNA t值P值子癇組對照組42 42 0.61±0.23 0.34±0.18 5.991＜0.001

圖2 子癇組和對照組胎盤組織中Gas6 mRNA表達的RT-PCR檢查結果電泳圖

2.4 相關性分析法 子癇組患者胎盤組織中Gas6 mRNA的表達水平與患者的收縮壓、舒張壓、Scr呈顯著正相關(P＜0.05)；子癇組患者胎盤組織中Gas6 mRNA的表達水平與白蛋白、血小板水平呈顯著負相關(P＜0.05)，見表5。

表5 相關性分析法

3 討 論

輕度子癇前期的孕產婦妊娠20周后出現收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg伴蛋白尿≥0.3 g/24 h或隨機尿蛋白≥+，而當血壓、血肌酐值、蛋白尿以及血清轉氨酶等指標進一步惡化時，患者進展為子癇的概率可明顯增加5%～10%[5-6]。相關妊娠期高血壓以及子癇前期的病因的探討認為，滋養細胞侵襲異常、免疫調節功能異常、內皮細胞損傷、遺傳因素和營養因素等方面均可獨立促進子癇前期的發生，滋養細胞侵入螺旋小動脈不全，子宮肌層螺旋小動脈未發生重鑄，異常狹窄的螺旋動脈使得胎盤灌注減少和缺氧，最終導致子癇前期的發生[7]。另外，絨毛膜細胞間質的纖維化以及血管再生的障礙，均可影響到胎盤血管的痙攣，進而促進血壓的波動或者收縮壓的升高。美國國立衛生院在分析鼠成纖維細胞在高血流灌注下的生物學功能改變中發現，Gas6作為調節局部免疫反應、血管的再生以及炎癥反應的重要介質，其對于下游信號通路acs-6/axl的激活以及Notch2/cyc/bcl調節，可以影響到血小板指數以及血小板活性達標率[8-9]，而Gas-6與絡氨酸家族受體的結合，可進一步促進絨毛膜間質細胞的纖維化，并影響胎盤血流動力學的穩定。本次研究重在探討Gas-6在子癇前期患者胎盤組織中的表達差異，進而揭示Gas-6在妊娠期高血壓疾病中的生物學功能。

血小板、血清白蛋白、血肌酐以及動脈血壓均為評估子癇前期患者病情程度的重要指標，子癇組和對照組患者動脈收縮壓以及舒張壓均明顯升高，血小板相對降低，不足250×109/L，其中子癇組患者的收縮壓可達160 mmHg以上，而舒張壓可達100 mmHg以上，血小板的上升提示患者體內的凝血功能存在一定的激活與紊亂，血小板活性的升高可促進血栓性疾病的發生，加劇在收縮壓大于160 mmHg情況下發生子癇的風險。通過免疫組化分析可見，在子癇孕產婦胎膜以及胎盤組織中，Gas-6的表達均明顯增強，Gas-6的表達主要位于絨毛膜滋養細胞內，定位于細胞膜內側，而細胞核周邊以及細胞間質中的Gas-6表達降低。胎膜以及胎盤組織中的Gas-6蛋白水平的高表達提示其與妊娠期高血壓或者子癇前期的發生有關，有研究表明在妊娠32～37周內發生子癇的孕產婦，其產后胎盤的免疫組化分析可見Gas-6表達陽性率達45%以上，明顯高于未發生子癇的孕產婦[10-11]，同時在胎盤血管再生不良以及部位間質纖維化較為明顯的孕產婦胎膜中，Gas-6的高表達與孕產婦體內血小板性血栓的形成以及粥樣斑塊的纖維化存在一定的關聯[12]。同時，Gas6 mRNA的表達與蛋白水平的表達具有一致性，在轉錄調節因子FXN-2的調節下，Gas6 mRNA翻譯表達為Gas6蛋白，其對于絡氨酸末端的羥基化可促進胎膜或者胎盤組織的間質纖維化，并可抑制血管內皮生長因子VEGF-2的表達，進而導致胎盤血管的再生性障礙，提高血流灌注的不穩定性。Gas6 mRNA以及蛋白高表達的孕產婦，其體內D-二聚體相對較高，而血小板相對較低，特別是血小板可下降至150×109/L左右，而D-二聚體亦大于2.5 mg/L，提示纖溶亢進以及凝血機制的異?？赡苁羌觿as6對子癇患者影響的重要因素之一。

子癇前期患者胎膜或者胎盤組織中的Gas6蛋白水平以及基因水平的高表達，與妊娠期高血壓疾病的發生具有顯著的關聯，Gas6的升高可能通過調節胎盤血管的形成、促凝機制以及影響絨毛膜間質細胞的纖維化，進而影響子癇前期的發生發展。

[1]楊孜.子癇前期多因素發病及多機制發病通路之綜合征再認識[J].中華醫學雜志,2015,95(1):7-9.

[2]李涵.micro RNA與子癇前期的研究進展[J].實用婦產科雜志, 2014,30(12):896-899.

[3]李銀鋒,顧焱,韓磊,等.細胞因子在子癇前期發病中的作用研究進展?[J].重慶醫學,2015,33(27):3863-3865.

[4]劉興會,王曉東,何國琳.子癇前期發病機制的研究現狀及展望[J].四川大學學報(醫學版),2015,46(1):99-103.

[5]陳國慶,張華,漆洪波,等.滋養細胞自噬在重度子癇前期發病中的作用與分子機制[J].細胞與分子免疫學雜志,2012,28(3):294-296, 300.

[6]尉陽,王蕾蕾,尚濤.靶向沉默Notch-1基因抑制滋養細胞上皮間質轉化的機制研究[J].中國醫科大學學報,2015,30(3):238-242.

[7]蔣峰麗,王翠娟,陳立群,等.MCP-1基因啟動子-2518位點多態性與子癇前期發病的相關性[J].中華婦產科雜志,2014,49(5): 369-371.

[8]周成,楊紅玲,曾芳玲,等.孕20周前血漿腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體與妊娠期高血壓疾病的關聯性研究[J].中華檢驗醫學雜志,2015,23(8):522-527.

[9]Roten LT,Thomsen LC,Gundersen AS,et al.The Norwegian preeclampsia family cohort study:a new resource for investigating genetic aspects and heritability of preeclampsia and related phenotypes [J].BMC Pregnancy Childbirth,2015,15(1):319-321.

[10]Tannetta DS,Hunt K,Jones CI,et al.Syncytiotrophoblast extracellular vesicles from pre-eclampsia placentas differentially affect platelet function[J].PLoS One,2015,10(11):148-152.

[11]Bashir SO,Suekit H,Elkarib AO,et al.The effect of high altitude on endothelial and vascular dysfunction markers in preeclamptic patients[J].Acta Physiol Hung,2015,102(4):391-399.

[12]Liu C,Luo R,Elliott SE,et al.Elevated Transglutaminase activity triggers angiotensin receptor activating autoantibody production and pathophysiology of preeclampsia[J].J Am Heart Assoc,2015,4(12): 95-96.

Expression of Gas6 in placenta or decidual tissue and its relationship with preeclampsia.

LI Qi-xia,HE Yu-lan,JIN Yu.Department of Obstetrics and Gynecology,the Fifth Affiliated Hospital of Southern Medical University,Guangzhou 510900,Guangdong,CHINA

Objective To investigate the expression of growth arrest specific protein 6(Gas6)in placenta or decidual tissue and its relationship with the pathogenesis of preeclampsia.MethodsFrom June 2012 to April 2015,42 pregnant women of severe preeclampsia undergoing cesarean delivery were selected as preeclampsia group,and 42 normal pregnant women undergoing cesarean section were chosen as the control group.Immunohistochemistry was used to detect the expression of Gas6 protein in placenta or decidual tissue,and reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)was used to detect Gas6 mRNA expression in placental tissue.The relationships of Gas6 mRNA with severe preeclampsia related indicators were analyzed.ResultsThe systolic blood pressure,diastolic blood pressure,serum creatinine(Scr)in preeclampsia group were significantly higher than those in the control group,(163.2±16.4)mmHg vs (119.5±8.3)mmHg,(101.4±9.5)mmHg vs(71.6±8.3)mmHg,(60.4±13.2)μmol/L vs(41.0±11.9)μmol/L,P＜0.05.The levels of albumin,platelet in preeclampsia group were significantly lower than those in the control group,(30.4±3.9)g/L vs(35.1±4.2)g/L,(167.3±54.1)×109/L vs(256.0±83.7)×109/L,P＜0.05.The expression intensity of Gas6 protein in placenta or decidual tissue was significantly higher in preeclampsia group than control group(P＜0.05).The Gas6 mRNA expression level in placenta was significantly higher in preeclampsia group than control group of(0.61±0.23)vs(0.34± 0.18),P＜0.05.The expression levels of Gas6 mRNA in placenta in preeclampsia group showed a significant positive correlation with systolic blood pressure,diastolic blood pressure,Scr(r=0.417,0.382,0.405,P＜0.05),but a significant negative correlation with albumin,platelet levels(r=-0.326,-0.314,P＜0.05).ConclusionPreeclampsia or placental decidua tissue Gas6 expression and the pathogenesis of preeclampsia.

Placenta;Decidual tissue;Growth arrest specific protein 6;Preeclampsia;Correlation

R714.24+5

A

1003—6350（2016）09—1402—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.09.010

2016-01-06)

廣州市醫藥衛生科技項目（編號：20141A041010）

李綺霞。E-mail：liqixia1979@sina.com