小檗堿在潰瘍性結腸炎中作用及機制的研究進展

張　蘇　王志斌　王　躍　仝令暢　王榮美　李　玲　張立超

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小檗堿在潰瘍性結腸炎中作用及機制的研究進展

張蘇王志斌王躍仝令暢王榮美李玲張立超

200071上海市中醫醫院藥劑科(張蘇，王躍，張立超；張蘇現為寧夏醫科大學藥學院碩士研究生)；200433上海，第二軍醫大學藥學院藥理教研室(王志斌，仝令暢，王榮美，李玲)

摘要：潰瘍性結腸炎(UC)是一種慢性非特異性腸道炎性疾病，其發病機制可能與遺傳、環境、免疫及微生物有關。小檗堿是黃連的主要成分，臨床上主要用于抗炎。近年來研究發現小檗堿對UC有良好的療效，但治療機制尚不完全清楚，可能通過調整腸道菌群結構、保護腸道屏障功能、調節免疫應答反應、影響氧化應激等來發揮治療作用，該文就此作一綜述，為小檗堿應用于UC治療提供理論依據。

關鍵詞：潰瘍性結腸炎；小檗堿；緊密連接；免疫調節；氧化應激

潰瘍性結腸炎(UC)是一種慢性非特異性腸道炎性疾病，其病程漫長，常反復發作、遷延不愈，且長期的UC易發生癌變。近年來UC的發病率呈上升趨勢，且趨于年輕化，以20～25歲患者居多。目前認為UC的發病可能與遺傳、環境、免疫和微生物有關，但其確切機制并不清楚。臨床上對UC的治療以氨基水楊酸類藥物、腎上腺糖皮質激素類藥物及免疫抑制劑為主，但都存在一定的不良反應，如胃腸道不適、過敏反應等。

小檗堿又稱黃連素，是從黃連、黃柏、三顆針等植物中提取出的一種異喹啉類生物堿，具有抗炎、抗菌等藥理作用。許多臨床研究和動物實驗研究證實，小檗堿對UC有良好的療效，其可能通過調整腸道菌群結構、保護腸道屏障功能、調節免疫應答反應、影響氧化應激等來發揮作用。本文就小檗堿治療UC的上述4個方面的作用機制作一綜述。

1調整腸道菌群

小檗堿的生物利用度較低，經腸壁吸收差，使得其在被腸上皮細胞吸收之前可以在腸道中發揮藥理作用。雙歧桿菌具有保護腸黏膜、改善腸壁通透性的作用。用小檗堿(10 mg/kg和20 mg/kg)治療三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的結腸炎小鼠后，用BL瓊脂板培養小鼠的新鮮糞便，發現小檗堿治療組的雙歧桿菌數量較對照組顯著增加(P<0.05)，癥狀得到改善，且具有劑量依賴性，這表明小檗堿可通過恢復雙歧桿菌的數量來保護腸道屏障[1]。

此外，小檗堿可通過影響腸道菌群的組成結構來調節結腸炎。雙歧桿菌、產乙酸細菌(Blautia屬)、支原體(Allobaculum屬)等可產生短鏈脂肪酸(SCFA)，結腸黏膜能量來源的60%～70%為SCFA(主要為乙酸和丁酸)，肝臟能量的主要來源為脂肪酸氧化，而SCFA可不需載體直接進入線粒體，參與氧化供能。給予TNBS誘導的Wistar大鼠小檗堿(100 mg/kg)口服，連續給藥18周后，發現小檗堿可顯著升高糞便中的SCFA濃度，特別是乙酸和丙酸，這表明口服小檗堿能選擇性地富集產SCFA的菌群，促進結腸內發酵，增加腸道中SCFA的產量，從而保護腸道屏障[2]。

2保護腸道屏障功能

2.1保護緊密連接

UC是一種腸黏膜炎性疾病，其發病和黏膜修復都與腸道屏障功能緊密相關。緊密連接(TJ)是構成腸上皮機械屏障功能最主要的結構，TJ的開放主要依賴于TJ蛋白的表達和分布，如咬合蛋白(occludin)、緊密連接蛋白-1(ZO-1)和閉合蛋白(claudin)等[3-4]。UC患者伴有TJ蛋白分布的改變。C57BL/6小鼠飲用含3% 葡聚糖硫酸鈉(DSS)的水4 d，給予小檗堿(100 mg/kg)灌胃處理3 d，取結腸組織免疫染色后發現，小檗堿阻止了DSS誘導的ZO-1從TJ復合體頂端向結腸上皮細胞的細胞質隔室的重分布[5]。

酪氨酸激酶Src(Tyr416)信號通路影響claudin-1的表達及其在TJ中的分布，蛋白激酶B(PKB/Akt)主要影響claudin-2的表達。claudin-1增多可降低大分子的細胞通透性，claudin-2則可誘導Na+、K+等陽離子和水的細胞通道開放[6]。用50 μmol/L小檗堿預處理HT-29/B6細胞10 min，再加入腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(500 U/mL)孵育15 min，免疫印跡結果顯示小檗堿可抑制TNF-α誘導的Akt(Ser473)、Akt(Thr308)及Src(Tyr416)磷酸化作用，并可下調claudin-2蛋白表達而上調claudin-1蛋白表達；激光共聚焦顯微鏡下可見，小檗堿可以逆轉TNF-α引起的claudin-1蛋白脫離TJ向頂端細胞質的重分布，表明小檗堿通過抑制Src、Akt磷酸化，調節claudin-1的表達和重分布及claudin-2的表達，從而發揮腸道屏障保護作用[7]。

2.2調節血小板聚集

血小板不僅具有止血和血栓形成的作用，還可以通過釋放炎性介質，擴大炎性反應。有研究發現，UC患者靜脈血中血栓素B2(TXB2)水平高于正常組，說明UC患者伴有血小板活化和高凝血狀態[8]。給予BALB/c小鼠飲用8% DSS以誘導UC模型，給予小檗堿(40 mg/kg和80 mg/kg)灌胃，結果顯示灌胃后第3天和第7天的血漿TXB2和P-選擇素水平均有顯著降低(P<0.01)，這表明小檗堿呈時間、劑量依賴性降低血漿TXB2和P-選擇素水平，從而改善DSS誘導的結腸炎小鼠血液的高凝狀態，減少血小板凝集[5,9]。

3調節免疫應答反應

3.1調節促炎細胞因子

小腸是分泌內源性TNF的主要器官。TNF-α是UC結腸損傷中細胞因子連鎖反應的關鍵性介質[10]。用50 μmol/L小檗堿預處理HT-29/B6細胞10 min后，用500 U/mL TNF-α孵化HT-29/B6細胞30 min，可減弱TNF-α誘導的Akt-P(Ser473)和Akt-P(Thr308)的磷酸化，表明小檗堿通過抑制PI3K/Akt信號通路中Akt的磷酸化作用而減弱TNF-α對腸道的損傷[7]。

干擾素-γ(IFN-γ)和TNF-α等細胞因子可通過影響TJ的結構和功能來破壞腸道屏障功能[11]。透射電鏡下可見，小檗堿(100 μmol/L)對IFN-γ(100 U/mL)和TNF-α(10 ng/mL)處理Caco-2細胞后導致的細胞間TJ結構不完整、出現部分斷裂有明顯抑制作用；Transwell實驗結果顯示，經小檗堿處理后，異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖(FD-4)的流出速率較對照組顯著降低，表明小檗堿能抑制促炎細胞因子造成的TJ破壞，從而降低腸上皮細胞的通透性[12-15]。

免疫系統功能紊亂及各類免疫細胞表達失衡在UC發生發展中起重要的作用。有研究發現CD4+T亞型Th1/Th17細胞分化調節控制的炎性細胞因子IFN-γ、白細胞介素-17(IL-17)表達失衡在UC的發病中起作用。有研究用2.5% TNBS誘導BALB/c小鼠，給予小檗堿(100 mg/kg)治療，可降低結腸組織中IFN-γ和IL-17的水平，流式細胞術發現小檗堿可降低脾臟中Th1細胞(分泌IFN-γ)、Th17細胞(分泌IL-17)的細胞比例及CD4+CD25+Foxp3+T細胞(Treg細胞)的數量，表明小檗堿可通過下調Th1和Th17細胞亞群比例及抑制Treg細胞的分化，進而降低炎性因子的水平，緩解腸道炎性反應；此外，小檗堿可下調脾臟純化得到的CD4+T細胞中信號轉導與轉錄激活因子1(STAT1)、STAT3的磷酸化，STAT信號通路是Th1、Th17細胞分化的重要通路，表明小檗堿通過抑制STAT1、STAT3的磷酸化，進而抑制Th1、Th17細胞的分化，從而控制炎性反應[16]。

3.2調節轉錄因子

核因子-κB(NF-κB)的信號級聯放大在炎性反應應答中具有重要作用，其能促進促炎因子、趨化因子、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、環氧合酶(COX-2)、黏附分子和炎性反應受體的表達。用50 μmol/L小檗堿預孵化HT-29/B6細胞10 min，可抑制TNF-α誘導的NF-κB和IκBα磷酸化，其減弱TNF-α的效應類似于NF-κB的特異性抑制劑BAY11-7082(10 μmol/L)[ 17]。用50 μmol/L小檗堿孵育Jurkat細胞18 h，再用0.1 nmol/L TNF-α孵育10 min，發現小檗堿可以抑制NF-κB p65的磷酸化、核移位及IκBα降解，并可完全抑制IκB激酶(IKK)的激活[18]。50 μmol/L小檗堿孵育Jurkat細胞18 h，再用50 μg/mL蛋白酶體抑制劑ALLN孵育30 min，最后用0.1 nmol/L TNF-α處理10 min，免疫印跡分析胞質提取物發現小檗堿可以明顯抑制IκBα磷酸化。這些結果表明小檗堿的抗炎作用通過NF-κB信號通路抑制IKK的激活，導致IKK穩定化，進而抑制IκBα的降解，還可通過抑制NF-κB和IκBα的磷酸化從而抑制NF-κB活化[17-18]。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是信號從細胞表面轉導到細胞核內部的重要傳遞者，其可分為4個亞族：細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)、p38、C-Jun氨基末端激酶(JNK)/應激激活蛋白激酶(SAPK)和ERK5。UC患者體內MAPK的激活增加，內毒素(LPS)刺激的腹腔巨噬細胞中MAPK的激活也增加。C57BL/6小鼠飲用含3% DSS的水4 d后，用小檗堿(100 mg/kg)灌胃處理3 d，免疫印跡結果顯示小檗堿可抑制由DSS引起的結腸上皮細胞的ERK1/2、p38、JNK的磷酸化，表明小檗堿通過抑制ERK1/2、p38、JNK的磷酸化從而抑制MAPK的激活，進而阻斷信號傳遞[5,19]。

3.3調節中性粒細胞

TNF-α能夠刺激血管內皮細胞及中性粒細胞(PMN)表達表面黏附分子，促進PMN聚集，利于PMN釋放活性氧(ROS)和蛋白水解酶等，從而加重結腸的損傷程度。用30 g/L DSS誘導Wistar大鼠7 d，再給予小檗堿(50 mg/kg)3 d，免疫組織化學結果顯示小檗堿可下調DSS引起的結腸組織細胞間黏附分子(ICAM-1)的表達，并可減少結腸組織中PMN的表達，說明小檗堿通過抑制PMN與內皮細胞黏附分子的表達，進而減少炎性細胞浸潤，減輕炎性反應[20-21]。

髓過氧化物酶(MPO)主要由PMN、單核細胞和某些組織的巨噬細胞分泌，外界刺激可導致PMN聚集并釋放MPO。C57BL/6小鼠飲用含3% DSS的水4 d后，用小檗堿(100 mg/kg)灌胃處理3 d，與對照組相比較，發現小檗堿可顯著抑制DSS誘導的MPO活性及含量增加，表明小檗堿通過抑制MPO的活性來改善UC的癥狀[5,20,22]。

3.4調節內質網應激

內質網(ER)是哺乳動物細胞中一種重要的亞細胞器，具有蛋白質修飾、加工以及新生肽鏈的折疊、組裝和運輸的重任。機體內外環境改變，均可造成未折疊或錯誤折疊蛋白質在ER內蓄積，引發內質網應激(ERS)。持續而嚴重的ERS，可觸發ER相關性細胞凋亡，造成細胞損傷。X-盒結合蛋白1(XBP1)是ERS過程中重要的信號通路，敲除小鼠腸上皮細胞中的XBP1基因可引起腸道發生自發性炎性反應，其組織學改變與人類UC相似，說明ERS在UC的發生發展中起著重要的作用[17]。

GRP78又稱免疫球蛋白重鏈結合蛋白(Bip)，是一種ER分子伴侶蛋白，在維持ER蛋白質合成、正確折疊和細胞鈣穩態等方面起著重要的作用。ERS時GRP78的表達上調。持續的ERS啟動天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-12(caspase-12)的凋亡途徑，造成細胞損傷。caspase-12活化后可以誘導caspase-3表達升高，共同誘導細胞凋亡。用20 μmol/L小檗堿預處理Caco-2細胞2 h，再用2.5 ng/mL IFN-γ和50 ng/mL TNF-α孵育24 h，結果顯示小檗堿可顯著降低GRP78的表達，降低剪切形式的XBP1 mRNA水平以及抑制caspase-3升高，這表明小檗堿能抑制ERS，達到減輕腸道炎性反應和保護腸道的作用[23]。

4影響氧化應激

體內的高活性分子如ROS和活性氮(RNS)產生過多，引起氧化系統和抗氧化系統失衡，從而導致組織損傷[24]。UC患者體內ROS和一氧化氮(NO)明顯增多，引起體內氧化、結腸組織和細胞損傷，形成周而復始的連鎖反應[25]。用30 g/L DSS誘導Wistar大鼠7 d，再給予50 mg/kg小檗堿3 d，免疫組織化學結果顯示小檗堿可抑制結腸組織iNOS的表達；此外小檗堿可顯著增加血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性，并可明顯抑制丙二醛(MDA)、NO水平，這表明小檗堿可通過增強抗氧化系統、抑制氧化系統來調節腸道內的氧化應激，減輕黏膜損傷[26-27]。

5結語

UC是目前胃腸道難治性疾病之一，易反復發作，小檗堿主要通過調整腸道菌群結構、保護腸道屏障功能、調節免疫應答反應及影響氧化應激等發揮治療UC的作用。然而，現有研究仍不能完全解釋小檗堿治療UC的具體機制，需要更多動物或臨床研究結果揭示其作用機制，為小檗堿應用于UC提供理論依據。

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(本文編輯：林磊)

基金項目：國家自然科學基金(81273504，81473258，81402941)

通信作者：張立超，Email: changhaiskin@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1673-534X.2016.03.002

(收稿日期：2015-11-25)